第12章-激光共聚焦显微镜术

第八章激光扫描共聚焦显微镜术,光学显微镜作为细胞生物学的研究工具可以分辨出小于其照明光源波长一半的细胞结构。随着光学、视频、计算机等技术的发展而诞生的激光扫描共聚焦显微镜（laserscanningconfocalmicroscope，LSCM），使现代光学显微镜有能力研究和分析细胞在变化过程中的结构，特别是对活细胞离子含量变化的定量检测，这是以往的显微镜所望尘莫及的。,第一节LSCM的结构和原理,1957年，MarvinMinsky提出了共聚焦显微镜技术的某些基本原理，获得了美国的专利。1967年，Egger和Petran成功地应用共聚焦显微镜产生了一个光学横断面。1977年，Sheppard和Wilson首次描述了光与被照明物体的原子之间的非线性关系和激光扫描器的拉曼光谱学。1984年，Biorad为公司推出了世界第一台商品化的共聚焦显微镜，型号为SOM-100，扫描方式为台阶式扫描。1986年MRC-500型改进为光束扫描，用作生物荧光显微镜的共聚焦系统。随后Zeiss、Leica、Meridian、Olympus等多家公司相继开发出不同型号的共聚焦显微镜，应用的范围也越来越广泛。,一、LSCM的基本结构LSCM是将光学显微镜技术、激光扫描技术和计算机图像处理技术结合在一起的高技术设备。其主要配置有激光器、扫描头、显微镜和计算机四大部分。包括数据采集、处理、转换及相应的应用软件，图像输出设备及光学装置，如光学滤片、分光器、共聚焦针孔及相应的控制系统（图8-1）。现以MRC-1024型LSCM为例进行介绍。1激光器采用的是气冷式氪-氩离子混合激光管，输出功率为15mW，激发光波长为488、568及647nm，激光束通过光纤电缆导入扫描头。,2扫描头扫描头可以分为：探测通道，由光电倍增管（photomultipletube，PMT）和相应共聚焦针孔及滤过轮组成；滤光块，本机配有进行细胞标记用的T/1T2A滤光块，有测活细胞钙离子的B1及Open滤光块，测pH值及其它离子，可根据标本和目的进行不同选择；扫描头，有管道与光学显微镜相连接。3光学显微镜可配置直立或倒置显微镜，MRC-1024型LSCM配置的是ZeissAxiovert100型倒置显微镜。镜头倍率和数值孔径是固定的。,4计算机及界面（1）计算机：硬件，内存32MB，硬盘12GB；软件，用于图像采集和分析的OS/2，Window5.0等和测定钙离子的Time-Course/Ratiometric等软件。（2）MRC-1024共聚焦界面。硬件，24比特图像获得及显示卡；软件，Lasersharp等。（3）显示器：17寸彩色监视器，分辨率12801024。,二、LSCM的工作原理传统的光学显微镜使用的是场光源。由于光散射，在所观察的视野内样品的每一点都同时被照射并成像，入射光照射到整个细胞的一定厚度，位于焦平面外的反射也可通过物镜而成像，使图像的信噪比降低，影响了图像的清晰度和分辨率。此外，传统的光学显微镜也只能对局部作平面成像。LSCM采用激光束做光源，激光束经照明针孔，由分光镜反射至物镜，并聚焦于样品上，对标本内焦平面上的每一点进行扫描。然后，激发出的,荧光经原来入射光路直接反向回到分光镜，通过探测针孔先聚焦，聚焦后的光被光电倍增管增强，在检测小孔平面被探测收集，并将信号输送到计算机，在彩色显示器上显示图像。在这条光路中只有在焦平面上的光才能穿过探测针孔，焦平面以外区域射来的光线在探测小孔平面是离焦的，不能通过小孔。因此，非观察点的背景呈黑色，成像也不清晰。由于照明针孔与探测针相对于物镜平面是共扼的，焦平面上的点同时聚焦于照明针孔和发射针孔，焦平面以外的点不会在探测针孔处成像，即共聚焦。以激光做光源并对样品进行扫描，在此过程中经过两次聚焦，故称为激光扫描共聚焦显微镜,图8-1激光共聚焦扫描显微镜的原理（光路图）,第二节LSCM的标本的处理,生物标本的范围很广，苯节主要指医学研究领域的组织或细胞标本。激光共聚焦显微镜可以观察石蜡切片、冰冻切片、涂片、印片、铺片，培养的贴壁细胞、悬浮细胞等。可根据不同的观察目的进行不同的染色。,一、取材1组织标本组织标本主要取之活组织检查标本、手术切除标本、动物模型标本以及尸体解剖标本。前三者均可为新鲜组织，后者一般是机体死亡2h以上的组织，组织细胞会有不同程度的自溶，细胞组织的生化成分和抗原成分有变性消失和严重的弥散。因此，对于新鲜采集或尸检标本同样要尽快处理，或立即速冻进行冰冻切片，或立即用固定液固定，进行脱水、浸蜡、包埋、石蜡切片。如不能迅速制片，可贮存于液氮或-70冰箱内备用。,2细胞标本(1)贴壁生长的培养细胞可直接进行固定、染色等处理。(2)悬浮的培养细胞：沉淀涂片，细胞离心涂片器（cytospin），载玻片上涂粘附剂：如多聚赖氨酸（0.01%0.5%），甲醛-明胶，铬矾明胶，Vectabond试剂。(3)体液沉淀涂片法。(4)穿刺吸取涂片法。,二、固定要特别注意固定剂的种类、固定的时间、温度和pH。选择最佳固定液标准是最好地保持细胞和组织的形态结构；最大限度地保存抗原的免疫活性（一些含重金属的固定液在免疫组化和细胞化学技术中是禁用）；不要用可能带有自发荧光的固定剂，如带有苦味酸的固定剂，还有甲醛升汞固定液，会使上皮细胞产生非特异性荧光（参见有关章节）。,三、切片由于激光穿透力强，所以用于激光共聚焦显微镜观察的切片厚度可放宽至4050m，切片不要太薄，以免结构的丢失。1冰冻切片为免疫组织化学染色中最常用的一种切片方法。其最突出的优点是能够比较完好地保存多种抗原的免疫活性，尤其是细胞表面抗原更应该采用冰冻切片。新鲜的组织及已经固定的组织均可作冰冻切片。冰冻切片后如果不染色，必须吹干，贮存于低温冰箱内，或进行短暂预固定后贮存于冰箱中。,2石蜡切片其优点是组织结构保存良好，在病理和回顾性研究中有较大的实用价值，能连续切片（薄片），组织结构清晰，抗原定位准确。用于免疫组织化学技术的石蜡切片制备与常规制片略有不同，主要是要在比较低的温度下进行。3振动切片可以把新鲜组织（不固定不冰冻）切成20100m的厚片，以漂浮法进行染色。组织不冰冻，无冰晶形成和组织抗原破坏，在免疫组化染色前避免了组织脱水、透明、包埋等步骤对抗原的损害，能比较好地保留组织细胞内脂溶性物质和细胞膜抗原。,四、染色和封固LCSM一般采用免疫荧光染色，具体方法参见荧光染色的有关章节。注意染色后要尽快观察，切片要避光保存。封固常用甘油和0.5mol/LpH9.09.5的碳酸盐缓冲液的等量混合液。由于激光共聚焦显微镜观察采集图象很快，所以一般用PBS或生理盐水也可以。如需将染色后的样品保存一段时间，可以用指甲油在盖玻片周围封闭，暗处保存。,五、影响荧光组织细胞染色的因素荧光染料是否发射荧光或荧光的强弱，主要决定于该染料的分子结构。同时，与它所处的环境及其状态也有密切关系，如:1pH值每种荧光素有其最适宜的pH值，改变pH值即可影响荧光素吸收光能的能力和发射荧光的强度。2染色溶液的浓度一般荧光色素的溶液极淡，增加浓度，荧光亮度也会随之增加，但溶液浓度增加到一定程度时，荧光亮度可达到最大。如果再增加浓度，荧光亮度反而会下降。这是因为由于溶液的浓度过大，色素分子间相互作用形成缔合分子，缔合分子本身起到了荧光淬灭剂的作用。,3温度有些荧光色素在20时即开始出现荧光淬灭作用。温度越高淬灭作用越强，以至完全淬灭。所以荧光染色必须温度适当,才能获得良好的效果。荧光抗体一般在37或4下进行。FITC影响不大。4荧光淬灭物质（1）卤酸盐，其中以碘离子作用最强，其次为溴离子，氯离子作用最小。（2）具有氧化作用的物质如氨基苯、硝基苯等。（3）某些金属离子，如铁离子、银离子等。5激发光强度物质的分子和荧光色素的结合键有一定强度，如果吸收的激发光能超过了它的结合键的结合力，很容易使结合键断裂，而造成荧光发生褪色（淬灭和漂白）。对之可降低激发光的强度,第三节LCSM的主要功能一、图像分析1提高分辨率通过使用荧光素交联的抗体作为特异性的染料来测定细胞内的某些参数，在生物学研究中已获得普遍应用。但这一技术常存在不在焦平面上荧光的干扰，造成本底较高，而分辨不清组织结构的细节。由于LSCM的分辨率小于0.2m，比普通光学显微镜高1.4倍，因此同一样品，用LSCM观察到的图像比普通光学显微镜清晰，观察荧光染料标记的样品，其效果更为明显。同时LSCM将高敏感性的光电倍增管（PMT）合为一体，并应用数字滤过，使信/噪比最佳化，排除了焦点以外的荧光干扰。,2细胞CT共聚焦成像利用照明点与探测点共扼这一特性，可有效抑制同一焦平面上非测量点的杂散荧光及来自样品中非焦平面的荧光，不仅可获得普通显微镜无法达到的分辨率，同时具有浓度识别能力及纵向分辨率，因而可看到较厚生物标本的细节。它以一个微动步进马达控制载物台上下步进移动，其最小步距可为0.1m，可以逐层获得高反差、高分辨率、高灵敏度的二维光学横断面图像，从而对生物样本进行无损伤的光学切片，得到各层面的数据，即“细胞CT”。这一技术克服人工切片的各种不足，并可将多层影像进行叠加，经计算机三维重建后得到样品的立体结构。这是LSCM的主要功能与优点之一。,3三维重建图象三维重建后的图像不但能揭示细胞内部的结构，而且还可以提供细胞的立体数据，如将重组的图像旋转，随意观察细胞的各个侧面。也可研究细胞内亚微结构的立体形态学变化及其空间关系。同时LSCM还可研究细胞核和染色体的三维立体形态，借助光学切片功能测定细胞深层的荧光分布及细胞内各种物质的变化。如对DNA、RNA，蛋白质的含量，分子的扩散，细胞骨架等进行准确的定性、定量、定位。LSCM还可用于测定细胞面积、细胞周长和细胞核面积、从而使形态学研究更为客观。同时通过改变观察角度还可以突出特征性的结构。,二、免疫荧光检测在普通荧光显微镜，由于荧光图像在显微镜视野中的荧光亮度与物镜的数值孔径的平方成正比，与其放大倍数成反比，因此放大倍数越高，其影响越明显。但对荧光不够强的标本，为提高荧光图像的亮度，又必须使用数值孔径大的物镜。这样就不可避免地要以缩小视野作为代价，造成图像信息的损失。LSCM由于其高度的敏感性，以及其后期图像处理的强大功能，可以在使用较小数值孔径物镜的条件下获得良好荧光强度图像。,1荧光定量测量荧光显微镜凭工作者目力观察，判断荧光的强度一般分为四级：“0”无或可见微弱荧光；“+”仅能见明确可见的荧光；“+”可见有明亮的荧光；“+”可见耀眼的荧光，这种判断方法带有很大的主观性。LSCM借助免疫荧光标记方法，与激光扫描、光学显微镜、计算机技术相结合，可对细胞内荧光标记的物质进行定性、定量监测。通过后期处理可对单标记或多标记的细胞或组织标本的荧光进行定量分析，同时还可将荧光像与定量图形重叠以显示荧光在形态结构上的精确定位。借助光学切片的功能可在毫不损失分辨率的条件下，测量标本深层的荧光强度，使实验数据更加充分和真实可靠。,2荧光多重标记荧光显微镜在进行多种标记物的观测时，需要更换特殊的滤片，以改变激发波长来达到观测目的。LSCM由于配有3个独立的PMT，可同时获取多种信号数据，24比特图像显示板可以使三色同时显示，所以可同时同屏采集和显示3个不同发射波长的荧光色和一个混合图像，可方便地进行双标或三标研究。如需要检测细胞膜、细胞核、细胞质内三种不同的物质，可采用三种不同荧光标记的抗体标记样品，经激光扫描、共聚焦采集数据后成像，即可在三个相应的部位观察到标记的抗体阳性反应，并有重叠图像显示相互的关系，同时可测得细胞的面积、周长，平均荧光强度、积分荧光强度以及胞质内颗粒的数目等，对细胞进行全方位的定量分析。,3荧光摄影荧光显微镜摄影对于记录荧光图像十分必要，由于荧光很容易衰减，需要及时地记录实验结果。虽然方法与普通显微镜摄影技术基本相同，但是需要采用ASA值在200或400以上的高速感光胶片。因紫外光下照射30sec，荧光亮度降低50%，因此曝光速度过慢，就不能将荧光图像拍摄下来。应用LSCM即可克服以上缺点，不仅可快速记录较弱的荧光图像，而且通过后期的计算机辅助的图像处理过程，可以将图像以数字化的方式，通过与之相连的数字化摄影装置很方便地加以拍摄，制作照片。,三、细胞间通讯研究多细胞生物体中，细胞间相互影响和控制的生物学过程称为细胞间通讯（intercellularcommunication）。缝隙连接通讯是接触细胞之间的一种最普遍的细胞通讯方式，在相邻细胞膜的缝隙连接部位有对应的连接构成直径约为1.5nm的亲水性连接通道，它允许分子量小于1.5kD的分子向不同的方向流动，如无机离子、糖、氨基酸等可来往于相邻细胞之间，以维持相邻细胞间无机分子的平衡，并形成电生理反应和代谢变化的耦联。,LSCM可用于测定细胞之间的细胞间通讯与介导的分子转移，尤其是缝隙连接通讯与生长调控及癌变的关系日益受到重视。细胞增殖的调控是在外来信号的刺激下，通过细胞内部自身调控系统的作用进行。细胞内调控信息借助一些离子和小分子物质传递，这些物质在细胞之间的流动受到缝隙连接的精确控制。LSCM可通过刮除负载（scrapeloading）技术、荧光光漂白后恢复（fluorescenceredistributionafterphotobleaching，FRAP）技术和应用缝隙连接蛋白（connexin）的免疫荧光染色对缝隙连接进行研究。,LSCM对细胞间通讯的研究可用于以下几个方面：从形态学上观察细胞间连接的变化以及某些连接蛋白、粘附因子，从而阐明肿瘤细胞间通讯的形态学基础；测量由细胞缝隙连接介导的分子转移；测定某些因子对神经元间通讯的影响，如胞内Ca2+浓度，pH值，cAMP水平对缝隙连接的调节；用FRAP技术借助于高强度脉冲式激光照射细胞的某一区域，从而造成该区域光分子的光淬灭，该区域周围的非淬灭荧光分子将以一定的速率向受照区域（漂白区）扩散，用LSCM的低强度激光扫描可直接对此扩散速率进行定时检测，由此监测荧光标记分子通过缝隙连接的情况；通过测定某些药物对神经元通讯的影响，寻找新的药物。,四、细胞内离子分析LSCM可以准确地测定细胞内Ca2+、K+、Na+、Mg2+等离子的含量，最常用的是Ca2+的测定。Ca2+在细胞生命活动中作为信息传递、递质合成与释放等的第二信使，其在细胞内浓度变化很大程度上影响着诸如细胞运动、电兴奋、细胞分化、增殖和糖代谢等生理功能的改变。正常情况下，细胞内游离Ca2+浓度并不是一成不变的，胞内Ca2+周期性的变化是细胞生理功能的体现。在大多数神经元，胞内Ca2+的升高并非是单一性持续增加，而是波动性升高，称为钙振荡（calciumoscillation），代表了Ca2+升高的时间分布。,在一些神经元，Ca2+的升高不单是由于钙扩散所致，而且还以“波”的形式从刺激点向整个细胞扩散，这种钙波（calciumwave）代表了Ca2+的空间分布。神经元在外界条件刺激或病理状态下，胞内Ca2+的浓度会发生相应的变化。通过对钙振荡与钙波的监测记录，可以间接了解Ca2+对刺激介质，如化学因子、生长因子、药物及各种激素的反应和作用，对揭示神经元活动的机制具有重要意义。许多通过细胞膜的信号转导是在第二信使参与下完成的，如三磷酸肌醇可以打开Ca2+通道引导游离Ca2+的变化，从而可推导Ca2+介导下的其它信号转导情况。,五、细胞膜流动性的测定细胞膜荧光探针受到激发后，其发射光极性依赖于荧光分子周围的膜流动性，故极性测量可间接反映细胞膜的流动性。因此，通过专用计算机软件，LSCM可对细胞膜流动性进行定量和定性分析。细胞膜流动性的测定在膜磷脂脂肪酸组成分析、药物效应和作用位点、温度反应测定等方面有重要作用。,六、控制生物活性物质的作用方式许多重要的生物活性物质和化合物（神经递质、细胞内第二信使、核苷酸等）均可形成笼锁（caged）化合物。当处于笼锁状态时，其功能被封闭；一旦被特定波长的瞬间光照射，则因光活化而解笼锁（uncaged），其原有活性和功能得以恢复，从而在细胞增殖分化等生物代谢过程中发挥作用。LSCM即具有光活化测定功能，可以控制使笼锁化合物探针分解的瞬间光波长的照射时间，从而人为地控制多种生物活性物质发挥作用的时间和空间。,七、激光显微外科手术台获取染色体特定位点的基因是分子生物学的研究热点，一般通过显微操作或显微切割进行。但这些方法技术难度大，难以掌握。LSCM可将激光作“光子刀”使用，借助相应的软件支持即可完成染色体精确地切割分离，神经元突起切除等一系列细胞外科手术。,八、光陷阱技术细胞骨架与细胞的形态功能密切相关。以前曾采用离心使细胞骨架扭曲的方法进行弹性测试，但对区段特异性流变缺乏时空分辨能力。光陷阱（opticallytrap）技术是利用激光的力学效应，将一个微米级大小的细胞器或其他结构固定于激光束的焦平面，因此又称为光钳（opticaltweezer）。可利用光钳技术来移动细胞的微细结构（如染色体、细胞器）、进行细胞融合及细胞骨架的弹性测定等。随着这一技术的发展和完善，必将成为研究细胞内微细结构和功能关系的重要手段。,第四节LSCM在神经生物学研究中的应用,LSCM既能对神经元的荧光作定量、定位、定性和定时分析，又可对神经元进行分类选择和各种激光显微操作，是目前唯一具备多功能的细胞工作站。,一、定量荧光测定LSCM可对活细胞进行定量荧光测定，并具有很好的重复性，能用于分析神经元和胶质细胞的某些物理及生物化学特性。LSCM不仅可对细胞的溶酶体、线粒体、内质网、细胞骨架、结构性蛋白、DNA、RNA、酶和受体分子的含量、成分及分布进行定性和定量测定，还可测定细胞的膜电位、氧化-还原状态及配体结合等生化反应。利用LSCM的定量荧光测定功能，还可进行神经细胞DNA损伤和修复的定量分析及原位杂交测定。有人在激光扫描共聚焦显微镜上，用原位杂交方法研究了小鼠大脑神经元内-谷氨酰半胱氨酸（-glutamylcysteine）合成酶mRNA的分布及药物对其表达的影响。,LSCM还适用于高灵敏度快速的免疫荧光定。它可以准确监测抗原表达、细胞结合和杀伤等特性。Washington等用免疫荧光双标染色的方法，在多发性硬化病人的大脑活检标本上，观察到病变脑组织的微血管内皮细胞特异性表达血管内皮细胞黏附分子-1（VCAM-1），而正常脑组织微血管内皮细胞很少或几乎不表达这些抗原。选择荧光标记物的测量方法主要从三个方面考虑：首先是测量仪器的激发波长，其次是荧光探针的光谱性质，三是仪器所配的荧光滤波片。此处只介绍荧光测量的基本方法：,1单激发单发射（single-excitationandsingle-emission）通常条件下荧光强度F与探针浓度C（探针浓度较低）的关系是：F=K（）C，即荧光强度与荧光探针的浓度成正比，其中K（）是与浓度无关的系数。通过测量细胞荧光强度即可获得细胞内荧光探针的浓度或含量。为了使不同的实验结果具有可比性，要求实验室所用的激发光强度、PMT所加压相同。由于确定公式中的K（）值比较困难（它与激发光强度、荧光探针的吸收系数、荧光发射效率等因素有关），此法多用于定性测量，如比较细胞内荧光探针所标记物质的含量高低，分析细胞内物质动态变化规律。,2比率法（ratiomethod）用于定量检测细胞内荧光标记物质的浓度或含量，包括单激发双发射（single-excitationanddualemission）方法和双激发单发射（dual-excitationandsingle-emission）方法。现以单激发双发射为例介绍：某种荧光探针在波长为1和2出的荧光强度为I1和I2，两种比值为：I1/I2=K（1）C/K（2）C=K（1）/K（2）,K（1）/K（2）的值仅取决于探针的荧光光谱性质，与荧光探针浓度和激发强度无关。细胞内环境变化（如胞浆pH、离子浓度等）可导致某些荧光探针的荧光光谱变化。因此，通过测定细胞内的这些探针的I1/I2比值，就可以推算出细胞内荧光标记物质的浓度和含量。比率法的优点是测量结果不受细胞内荧光探针浓度、分布及测量过程中探针泄漏等因素的影响。但并非所有探针均可采用比率法，能否采用比率法测量主要取决于探针的光谱性质（吸收光谱或发射光谱）。,3工作曲线（workingcurve）工作曲线是用来把荧光强度（或比值）换算成所测量物质的浓度或含量的曲线。以胞浆pH荧光探针SNAFL-calcein为例，假定在pH=7.0溶液中，波长1的荧光强度为I1，波长2的荧光强度为I2，两者比值为Ratio=I1/I2。不同pH溶液中可得到相应的I1/I2比值，然后以pH值为横坐标，I1/I2比值为纵坐标，用最小二乘法拟合曲线（图8-3）。如果测得某种细胞浆内该探针的两种波长荧光强度比值I1/I2=1.1，由工作曲线可以查得该细胞浆pH为7.3。比率法的测量结果与所选取的测量波长大小无关，但要求制定工作曲线所取的波长与实际测量所用图的波长一致。,8-3SNAFL-calcein工作曲线比率为I530/I605，激发波长488nm,二、细胞内离子的测定使用多种荧光探针，LSCM可对神经细胞的Ca2+、H+（pH）及其它各种细胞内离子进行定量和动态分析，也可用两种荧光探针对Ca2+和pH同时测定。Ca2+在神经细胞中起着重要的作用，它与神经的信号传递、递质释放、细胞死亡等均有密切关系。LSCM不仅可准确测定神经细胞不同部位的Ca2+含量，而且可动态观察Ca2+含量的变化。因此，LSCM目前在神经科学研究中用得最多的技术就是细胞内游离Ca2+的测定。该技术广泛应用于多种神经元和胶质细胞，如大脑皮层神经元、海马神经元、背根神经节细胞、交感神经节细胞、睫状神经节细胞、星形胶质细胞、少突胶质细胞、NG108-15细胞及PC12细胞等。,细胞内不同部位的游离Ca2+与第二信使及递质释放有密切的关系。Przgware等以Indo-1为钙的荧光探针，用LSCM测定鸡胚交感神经节细胞的胞体、突触及生长锥部位的Ca2+内流和分布，并同3H-去甲肾上腺素释放实验结合起来，观察Ca2+内流与递质释放的关系。结果表明，在交感神经节细胞的不同部位的Ca2+内流和分布明显不同，只有突触和生长锥部位的Ca2+含量与去甲肾上腺释放有关。他们还观察到电刺激和神经递质（如乙酰胆碱、5-羟色胺）通过不同途径激活蛋白激酶C，来调控交感神经节细胞内Ca2+含量和递质的释放。神经递质可提高细胞内IP3的含量，但不影响胞体部位的游离Ca2+，故认为胞体的钙库对IP3不敏感，且与去甲肾上腺素释放无关。电刺激不影响三磷酸肌醇（IP3）含量，但可提高胞内和生长锥部位的游离Ca2+含量/浓度，并可引起去甲肾上腺素的释放。由此可见，由于LSCM的应用，使神经生物学中的一些问题能够得到更深入地研究。,三、荧光光漂白恢复技术与胞间通讯研究荧光光漂白恢复技术（FRAP）是借助高强度脉冲式激光照射细胞的某一区域，从而造成该区域荧光分子的光淬灭，该区域周围的非淬灭荧光分子将以一定速率向受照区域扩散，而此扩散速率可通过低强度激光扫描探测。LSCM可直接控制光淬灭作用，并进行实时测定。该技术可用于研究神经元的骨架构成、核膜结构、跨膜大分子迁移率、细胞间通讯等。,Suter等用FRAP技术，在LSCM下研究神经毒剂dieldrin对初生大鼠大脑胶质细胞间缝隙连接通讯的影响时，观察到非中毒剂量的dieldrin能可逆地调节胶质细胞之间的缝隙连接通讯，而中毒剂量则对胞间通讯发挥抑制效应，故认为对胞间通讯的抑制可能是dieldrin产生神经毒性的机制。随后，Anders等到用类似方法观察了乳酸、脑蛛网膜软脑膜细胞及激光损伤神经元对星形胶质细胞之间缝隙连接通讯的影响。Legare等观察了神经细胞与星形胶质细胞间的缝隙连接通讯及药物对细胞之间通讯的影响，也取得了较好的结果。LSCM提供的细胞之间通讯的研究，为监测环境毒素和药物作用提供了一个重要手段。,四、定量共聚焦图像分析与三维图像重建共聚焦光学系统因为使用照明点与探测点共轭这一独特机构，从而有效地抑制同一焦平面上非测量点的杂散荧光，并且抑制来自非焦平面的荧光，使LSCM横向分辨率比普通光镜提高1.4倍，获得生物样品的高反差、高分辨率和高灵敏度的二维图像。而且LSCM具有深度识别能力，使其具有纵向分辨率，同时可标本进行无损伤光学切片，获得样品的系列光学切片及各层面的信息，通过三维重建得到样品的三维立体结构。,三维重建可以揭示亚细胞结构的空间关系：如单个细胞光学切片的细胞内离子Ca2+、K+、Na+、Mg2+、pH等比率测定，并测定各种离子的动态变化。测定光学切片的物理、生物化学特征变化，包括DNA、RNA、蛋白和胞内离子的含量及分子扩散等。细胞特异性结构的探测和分析，如线粒体、内质网、高尔基体、微管、微丝、染色体细胞膜系统、细胞骨架系统等，也可对这些结构进行准确的定性、定量、定位和定时测定。,五、粘附细胞分选与细胞激光显微手术Meridian公司生产的LSCM可用Cookie-CutterTM切割法和激光消除法对粘附细胞进行筛选、分离和克隆。LSCM可将激光当作“光子刀”，进行细胞膜瞬间穿孔，切除线粒体、溶酶体、切割染色体及切除神经元突起等细胞显微手术。Sakai等曾观察过用激光切除神经元突起对神经元的影响。用LSCM还可进行光陷阱操作，来移动细胞的微小颗粒和结构，该项技术可应用于神经细胞的染色体移动、细胞器移动以及细胞骨架弹性测量等研究。此外，LSCM还有不少技术，如细胞膜流动性测定、笼锁-解笼锁测定等对于神经生物学研究也很有价值。,第五节LSCM常用荧光染料的应用,一、用BCECP测定pH值1染色方法（1）将培养的细胞用PBS（含Ca2+、Mg2+）洗两遍。（2）加入BCECF-AM，终浓度15mol/L，在37孵育3060min。（3）用PBS（含Ca2+、Mg2+）洗两遍后进行LSCM观察。2储存液将BCECF溶于DMSO溶液，浓度1mmol/L，避光20保存。,二、用Snarf-I定量定比例测定pH值1染色方法（1）将培养细胞用PBS（含Ca2+、Mg2+）洗两遍。（2）加入Snarf-IAM，终浓度15mol/L，在37孵育3060min。（3）用PBS（含Ca2+、Mg2+）洗两遍后进行LSCM观察。2储存液将BCECF溶于DMSO溶液，浓度1mmol/L，避光20保存。,三、用Indo-I测量细胞内Ca2+Indo-I（分子量840D），标记活细胞内Ca2+，常选用Indo-IAM，其分子量为1010D，呈