液相色谱仪日常维护和故障排除

液相色谱仪日常维护和故障排除,xx/xx/xxxx,1,MerckEditor:Presentationnamehere,维护流程图,吸滤头,单向阀,柱塞密封圈,线路过滤器,手动进样器,检测器,日常维护,xx/xx/xxxx,2,MerckEditor:Presentationnamehere,材料：不锈钢烧结，孔径10um故障：堵塞表现：管路中不断有气泡生成措施：用520的稀硝酸，超声波清洗，再用蒸馏水清洗注意点：吸滤头拆下时不必将塑料管剪断,吸滤头,日常维护,xx/xx/xxxx,3,MerckEditor:Presentationnamehere,LC-10ATvp泵：串联式往复泵,LC-10ADvp泵：并联式往复泵,日常维护,串联泵、并联泵示意图,xx/xx/xxxx,4,MerckEditor:Presentationnamehere,日常维护,单向阀结构,球座,单向阀原理,xx/xx/xxxx,5,MerckEditor:Presentationnamehere,单向阀,日常维护,故障1：宝石球粘附于垫片表现：泵无法吸液或排液，流路不通措施：1）用针筒抽出口单向阀以产生负压，使宝石球与垫片分开2）拆下单向阀，放入异丙醇或水中，用超声波清洗,xx/xx/xxxx,6,MerckEditor:Presentationnamehere,单向阀,日常维护,故障2：宝石球或塑料垫片受污导致密封不好表现：系统压力波动大措施：拆下单向阀，放入异丙醇或水中，用超声波清洗,xx/xx/xxxx,7,MerckEditor:Presentationnamehere,故障：密封圈磨损导致密封不良现象：系统压力波动大或漏夜措施：更换密封圈注意点：1）流动相输送量达120L时，应更换密封圈2）更换前，新密封圈用异丙醇浸泡15min3）拆卸泵头前，柱塞杆复位（P-SET）,柱塞密封圈,日常维护,xx/xx/xxxx,8,MerckEditor:Presentationnamehere,故障：堵塞现象：系统压力波动大或压力偏高措施：5稀硝酸，超声波清洗判断依据：关闭排液阀，断开出口管路，设定流速1mL/min，如压力3kgf/cm2，则堵塞。,线路过滤器,排液阀,压力传感器,线路过滤器,流动相,日常维护,xx/xx/xxxx,9,MerckEditor:Presentationnamehere,进样器,自动进样器手动进样器原理：（六通阀）注入方式：1）全量注入2）部分注入,日常维护,xx/xx/xxxx,10,MerckEditor:Presentationnamehere,手动进样器的六通阀原理图,装填状态,进样状态,日常维护,xx/xx/xxxx,11,MerckEditor:Presentationnamehere,操作注意点：1）插针应插到底2）不使用时将针头留在进样器内3）进样应使用液相色谱专用平头进样针4）清洗应使用专用针口清洗器,手动进样器,日常维护,xx/xx/xxxx,12,MerckEditor:Presentationnamehere,进样体积,检测器响应值,定量管体积的一半,3倍定量管体积,全量注入,部分注入,进样体积与响应值关系,日常维护,xx/xx/xxxx,13,MerckEditor:Presentationnamehere,色谱柱的维护,1、在使用新柱之前，最好用强溶剂在低流量下(0.2-0.3ml/min)冲洗30mins，长时间未用的分析柱也要同样处理2、定期使用强溶剂冲洗柱子3、使用缓冲盐时，要先用水冲洗，再用有机溶剂冲洗4、净化样品(过滤）5、分离条件（样品中杂质的分离，预处理）6、不使用时，要盖上盖子，避免固定相干枯7、使用预柱8、避免流动相组成及极性的剧烈变化9、避免压力脉冲的剧烈变化,日常维护,xx/xx/xxxx,14,MerckEditor:Presentationnamehere,更换氘灯（紫外检测器）,判断氘灯能量：设定220nm波长，检查参比池能量，如能量低于800，需更换氘灯。操作注意点：不要用手直接接触氘灯表面,日常维护,xx/xx/xxxx,15,MerckEditor:Presentationnamehere,故障：样品池受污表现：样品池和参比池能量相差较大(锯齿峰）检查方法：设定250nm波长，通甲醇或水，查看SMPLEN和REFEN，如两者相差较大，则样品池受污。措施：用针筒注入异丙醇，清洗样品池；如污染严重，拆开样品池，将透镜等放入异丙醇中超声波清洗。,紫外检测器,日常维护,xx/xx/xxxx,16,MerckEditor:Presentationnamehere,发现问题定位问题纠正问题防止问题的再发生,故障排除,xx/xx/xxxx,17,MerckEditor:Presentationnamehere,流动相的准备,1.使用色谱纯的溶剂和优级纯的试剂2.用0.45m(或更小）的滤膜将所用的溶剂和缓冲溶液过滤3.使用HPLC级(或梯度级)的溶剂4.使用醋酸盐缓冲溶液比使用磷酸盐缓冲溶液要好，但应注意醋酸盐缓冲液在近紫外区的吸收5.使用酸或碱准备缓冲溶液要比使用盐好6.使用0.04%的叠氮钠溶液以防止流动相长菌,溶剂,xx/xx/xxxx,18,MerckEditor:Presentationnamehere,甲醇乙睛正己烷,分析纯级和HPLC级溶剂的吸光度比较图,溶剂等级,xx/xx/xxxx,19,MerckEditor:Presentationnamehere,溶剂的过滤,为什么溶剂和样品要过滤?色谱柱：由于填料颗粒很细，色谱柱内腔很小，溶剂和样品中的细小颗粒会使色谱柱和毛细管容易堵塞。仪器：溶剂和样品中的细小颗粒会增加进样阀的堵塞和磨损，同时也会增加泵头内的蓝宝石活塞杆和活塞的磨损。用滤膜过滤时，特别要注意分清有机相（脂溶性）滤膜和水相（水溶性）滤膜。对于混合流动相，最好在混合前分别滤过。,xx/xx/xxxx,20,MerckEditor:Presentationnamehere,内径30mm：适用于大进样量的过滤，由0.22m和0.45m两种规格,材料有纤维素,醋酸纤维,聚四氟乙烯。13mm内径：适用于范围广的过滤，由0.22m和0.45m两种规格,材料为纤维素。3mm内径：适用于小进样量的过滤，由0.22m和0.45m两种规格。处理样品体积为7l。,样品过滤头的类型：,溶剂的过滤,xx/xx/xxxx,21,MerckEditor:Presentationnamehere,滤膜类型：聚四氟乙烯滤膜：适用于所有溶剂，酸和盐。醋酸纤维滤膜：不适用于有机溶剂，特别适用于水基溶剂。尼龙66滤膜：适用于绝大多数有机溶剂和水溶液，可以用于强酸，不适用于二甲基甲酰胺。再生纤维素滤膜：蛋白吸收低，同样适用于水溶性样品和有机溶剂,溶剂的过滤,xx/xx/xxxx,22,MerckEditor:Presentationnamehere,流动相脱气目的：除去流动相中溶解或因混合而产生的气泡，一般混合溶剂中能容纳的空气量往往要比单个溶剂所能容纳的空气总量要小气泡对测定的影响：1）泵中气泡使液流波动，改变保留时间和峰面积2）柱中气泡使流动相绕流，峰变形3）检测器中的气泡产生基线波动,溶剂,xx/xx/xxxx,23,MerckEditor:Presentationnamehere,流动相脱气,流动相脱气方法比较：,注意：1.加热是流动相脱气的最好方法，但不方便2.氦气脱气也很方便，仅需几分钟就可以完成3.真空过滤脱气效果较差，但很方便，也很经济，不失为一常规办法,溶剂,xx/xx/xxxx,24,MerckEditor:Presentationnamehere,缓冲溶液和离子对系统,1.应保持缓冲溶液的浓度在20mM到50mM之间，以获得最佳的分析结果2.浓度过低的缓冲溶液体系会导致峰形差，分辨率低,3.一种缓冲溶液的最有效的缓冲pH范围是偏离其pKa值1pH单位,不同缓冲体系的缓冲范围缓冲溶液种类pKa缓冲范围磷酸盐2.11.1-3.17.26.2-8.212.311.3-13.3醋酸盐4.83.8-5.8柠檬酸盐3.12.1-4.14.73.7-5.75.44.4-6.4,溶剂,xx/xx/xxxx,25,MerckEditor:Presentationnamehere,故障特征“鬼峰”(由已被污染的过滤头造成)保留时间不断改变(由于过滤头堵塞或部分堵塞),清洗步骤：1.水2.稀硝酸3.水4.异丙醇5.水(超声波清洗),流动相过滤头产生的问题,溶剂,xx/xx/xxxx,26,MerckEditor:Presentationnamehere,避免问题的“秘诀”,使用预柱保护分析柱（硅胶在极性流动相/离子性流动相中有一定的溶解度）大多数反相色谱柱的pH稳定范围是2-8.0避免流动相组成及极性的剧烈变化流动相使用前必须经脱气和过滤处理如果使用极性或离子性的缓冲溶液作流动相，应在实验完毕将柱子冲洗干净，并保存在乙腈（甲醇）中压力升高是需要更换预柱的信号,色谱柱,xx/xx/xxxx,27,MerckEditor:Presentationnamehere,色谱柱(压力)问题,当色谱柱连接到泵将柱子反向冲洗；和进样器时，压力柱头滤网堵塞更换滤网；特别高更换色谱柱柱头填料变脏将柱子反向冲洗；取下滤网，挖去柱头变脏的填料，填入新的填料；更换色谱柱当柱子连接到检测器时,压力很高柱子和检测器之间停泵!(危险：检测池可能会堵塞)的管道堵塞更换管子,可能原因解决办法,xx/xx/xxxx,28,MerckEditor:Presentationnamehere,压力高,没有出峰;峰高改变,解决问题,可能原因解决办法预柱堵塞更换预柱柱头堵塞更换柱头的滤网；反向冲洗柱子；更换色谱柱毛细管堵塞更换毛细管,可能原因泵没有开流速；系统有漏进样体积或浓度的重现性差,解决办法检查泵；检查接头；检查流动相的组成；检查系统是否有漏检查进样系统以及样品的均匀性,xx/xx/xxxx,29,MerckEditor:Presentationnamehere,噪音高或基线漂移,解决问题,可能原因柱子没有平衡好杂质组分从色谱柱中缓慢流出杂质在柱子中的富集检测器或色谱柱的温度差异系统有气泡检测器氘灯需更换电压不稳造成干扰,解决办法继续冲洗色谱柱至平衡利用强极性的溶剂冲洗色谱柱冲洗色谱柱；改进和提高样品的预处理；使用液相色谱纯的溶剂使用色谱柱恒温箱流动相脱气；使用反压调节器更换氘灯（氘灯使用寿命一般为1000小时）使用稳压电源；检查供电系统,xx/xx/xxxx,30,MerckEditor:Presentationnamehere,出现“鬼峰”,解决问题,可能原因上一针样品中没有完全流出的物质样品中未知的组分色谱柱被污染溶剂中有杂质流动相和溶解样品的溶剂不互溶三氟乙酸被氧化,解决办法待样品中的组分尽可能完全流出后才进下一个样品；每运行完一个样品后用强极性的溶剂冲洗色谱柱；改进样品的预处理；组分复杂的样品尽可能使用梯度解吸的方法改进样品的预处理每运行完一个样品后用强极性的溶剂冲洗色谱柱；改进样品的预处理使用色谱纯的溶剂尽可能用流动相溶解样品流动相尽量每天新配；使用三氟乙酸时，应使用抗氧剂,xx/xx/xxxx,31,MerckEditor:Presentationnamehere,出现肩峰或前延峰,解决问题,可能原因预柱被污染或选用了不合适的预柱柱头“塌陷”造成死体积或是柱子内部有短流出现溶解样品的溶剂选择错误干扰物质的存在；样品中的杂质色谱柱过载柱外效应的影响,解决办法更换预柱更换色谱柱用流动相溶解样品，如果不可以，应将进样体积降至很低（如1微升）改进样品预处理；用测试的混合物检验色谱柱；使用色谱纯溶剂将样品稀释检查毛细管连接,xx/xx/xxxx,32,MerckEditor:Presentationnamehere,峰形展宽,解决问题,解决办法更换色谱柱或预柱减少进样体积；稀释样品用流动相溶解样品使用浓度稍高的缓冲溶液或者换用其它的缓冲溶液检查毛细管连接检查是否有漏；使用小的检测池提高色谱柱温度使用内径较细的较短的毛细管连接；检查柱外死体积使用较小粒径填料的色谱柱；更换色谱柱,可能原因色谱柱或预柱被污染或不合适色谱柱“过载”或进样体积过大溶解样品的溶剂选用不当缓冲溶液的浓度太稀柱外效应的影响色谱柱和检测器之间有漏；检测器的检测池过大色谱柱温度太低；流动相的黏度太高连接用的毛细管太长；柱外死体积太大色谱柱柱效下降,xx/xx/xxxx,33,MerckEditor:Presentationnamehere,出现脱尾峰,解决问题,解决办法减少样品体积；增大色谱柱内径；使用高容量的固定相改进样品预处理；调节流动相的组成；使用测试样品混合物检查色谱柱；使用色谱纯溶剂使用流动相改性剂（如三乙胺）；提高缓冲溶液或盐溶液的浓度（离子对色谱）降低流动相的pH值；使用碱性去活的色谱柱更换滤网；使用柱前过滤系统；将样品过滤检查毛细管连接更换色谱柱；使用性质较温和的分离条件,可能原因色谱柱过载干扰峰；杂质硅胶表面未完全键合的硅羟基的影响色谱柱的滤网堵塞柱外效应的影响；死体积色谱柱有“塌陷”、短流或断流,xx/xx/xxxx,34,MerckEditor:Presentationnamehere,出现双重峰或分叉峰,解决问题,可能原因样品体积过大；色谱柱过载溶解样品的溶剂选用不当色谱柱有“塌陷”、短流或断流色谱柱滤网堵塞进样器没有彻底清洗,解决办法减少进样体积；稀释样品；将样品在流动相中溶解；如果不行，尽可能将进样体积降低（如1微升）更换色谱柱；使用较温和的分离条件更换色谱柱的滤网；使用柱前过滤装置；过滤样品彻底清洗进样器；更换进样器转子,xx/xx/xxxx,35,MerckEditor:Presentationnamehere,保留时间变长,解决问题,可能原因流速降低硅胶表面有活性点键合相流失流动相的组成有变化温度降低,解决办法检查系统是否有漏；更换泵的密封圈；排净气泡；使用流动相改性剂（如加入三乙胺）；使用碱性去活的色谱柱保持流动相pH值在2-7.5范围内检查泵；检查滤网；防止流动相的挥发或降解使用色谱柱恒温箱,xx/xx/xxxx,36,MerckEditor:Presentationnamehere,保留时间缩短,解决问题,可能原因流速升高色谱柱过载键合相流失流动相组成发生变化温度升高色谱柱老化,解决办法检查泵；检查流速降低样品的浓度或进样体积流动相的pH值保持在2-7.5范围内检查泵；检查滤网；防止流动相的挥发或降解使用色谱柱恒温箱更换色谱柱；使用预柱,xx/xx/xxxx,37,MerckEditor:Presentationnamehere,保留时间无规则改变,解决问题,可能原因流速发生变化色谱柱尚未平衡；缓冲溶液容量不够流动相组成发生变化；流动相中的溶剂互溶性差色谱柱温度发生变化杂质在色谱柱中“堆积”,解决办法检查是否有漏；更换泵的密封；排净气泡至少用10倍柱体积的流动相平衡色谱柱；使用的缓冲溶液浓度应保持在20mM至50mM之间检查泵；检查滤网；防止流动相的挥发或降解使用色谱柱恒温箱冲洗色谱柱；,xx/xx/xxxx,38,MerckEditor:Presentationnamehere,出现选择性差异,解决问题,可能原因流动相组成发生变化流动相的强度太小溶解样品的溶剂选用不当色谱柱的寿命已到；色谱柱被污染温度发生变化色谱柱之间的重现性有差异（如不同生产厂家的柱子）,解决办法检查泵；检查滤网；防止流动相的挥发或降解使用缓冲溶液和离子对系统将样品在流动相中溶解；如果不行，尽可能将进样体积降低（如1微升）更换色谱柱；改进样品预处理；使用测试样品混合物检查色谱柱；使用色谱纯溶剂使用色谱柱恒温箱更换色谱柱，同时检查色谱柱的生产厂家,xx/xx/xxxx,39,MerckEditor:Presentationnamehere,避免问题,确定问题所在！,将处理问题的时间降到最低,预测可能出现的问题,一次仅改变一种因素!,确保同样的问题发生过至少两次!,尽量预计下一个可能出现的问题，并尽快更正，以避免出现紧急情况!,对自己所做的故障排除工作作好记录!,解决问题,xx/xx/xxxx,40,MerckEditor:Presentationnamehere,HPLC分析方法开发中流动相的调整,xx/xx/xxxx,41,MerckEditor:Presentationnamehere,1由强到弱,一般先用90%的乙腈(或甲醇)/水(或缓冲溶液)进行试验，这样可以很快地得到分离结果，然后根据出峰情况调整有机溶剂(乙腈或甲醇)的比例。,xx/xx/xxxx,42,MerckEditor:Presentationnamehere,2三倍规则,每减少10%的有机溶剂(甲醇或乙腈)的量，保留因子约增加3倍，此为三倍规则。这是一个聪明而又省力的办法。调整的过程中，注意观察各个峰的分离情况。,xx/xx/xxxx,43,MerckEditor:Presentationnamehere,3粗调转微调：,当分离达到一定程度，应将有机溶剂10%的改变量调整为5%，并据此规则逐渐降低调整率，直至各组分的分离情况不再改变。,xx/xx/xxxx,44,MerckEditor:Presentationnamehere,梯度洗脱,xx/xx/xxxx,45,MerckEditor:Presentationname