丁香提取物抗菌机理的研究

2009, Vol. 30, No. 03食品科学基础研究88 丁香提取物抗菌机理的研究 张慧芸 1 , 2，孔保华2 , * ( 1 . 河南科技大学食品与生物工程学院，河南 洛阳 4 7 1 0 0 3 ，2 . 东北农业大学食品学院，黑龙江 哈尔滨 1 5 0 0 3 0 ) 摘 要：本实验对丁香提取物的抗菌机理做一些初步的研究和探索。丁香提取物作用于大肠杆菌和单增李斯特菌后， 检测细菌细胞 A T P含量、K+和 Na +含量、细胞裂解率的变化，结合透射电子显微镜图，分析丁香提取物的抑菌 机理。结果表明，丁香提取物快速杀死大肠杆菌和单增李斯特菌的原因主要是破坏了其细胞膜。 关键词：丁香提取物；抗菌机理；大肠杆菌；单增李斯特菌 S t u d y o n A n t i b a c t e r i a l Me c h a n i s m o f C l o v e E x t r a c t Z HA NG Hu i - y u n 1 , 2 ，K ONG B a o - h u a 2 , * ( 1 . C o l l e g e o f F o o d a n d B i o e n g i n e e r i n g , H e n a n U n i v e r s i t y o f S c i e n c e a n d T e c h n o l o g y , L u o y a n g 4 7 1 0 0 3 , C h i n a ； 2 . C o l l e g e o f F o o d S c i e n c e , N o r t h e a s t A g r i c u l t u r a l U n i v e r s i t y , H a r b i n 1 5 0 0 3 0 , C h i n a ) A b s t r a c t ：T h e m o d e o f a n t i b a c t e r i a l a c t i o n o f c l o v e e x t r a c t a g a i n s t L i s t e r i a m o n o c y t o g e n e s a n d E . c o l i w a s s t u d i e d . I n t r a c e l l u l a r A T P c o n t e n t , K + a n d N a+ e f f l u x a n d c e l l l y s i s w e r e m e a s u r e d a n d c e l l d a m a g e w a s v i s u a l i z e d u s i n g f l u o r e s c e n c e a n d t r a n s m i s s i o n e l e c t r o n m i c r o s c o p y . I n c o n c l u s i o n , t h e c e l l d e a t h o f L i s t e r i a m o n o c y t o g e n e s a n d E . c o l i s t r a i n s c a u s e d b y o f c l o v e e x t r a c t r e s u l t s f r o m c e l l m e m b r a n e d a m a g e . Ke y wo r d s ：c l o v e e x t r a c t ；a n t i b a c t e r i a l me c h a n i s m ；E . c o l i ；L i s t e r i a mo n o c y t o g e n e s 中图分类号：R 2 8 4 . 2 文献标识码：A 文章编号：1 0 0 2 - 6 6 3 0 ( 2 0 0 9 ) 0 3 - 0 0 8 8 - 0 4 收稿日期：2 0 0 8 - 0 1 - 0 9 基金项目：国家公益性行业( 农业) 科研专项经费项目( 2 0 0 8 3 2 6 0 0 1 ) 作者简介：张慧芸( 1 9 7 7 - ) ，女，讲师，博士，研究方向为畜产品加工。E - ma i l ：z h a n g h u i y u n 2 1 1 6 3 . c o m * 通讯作者：孔保华( 1 9 6 3 - ) ，女，教授，研究方向为畜产品加工。E - ma i l ：k o n g b h 6 3 h o t ma i l . c o m 从天然产物中提取有关抗菌活性物质报道较多，但 有关它们的抗菌机理的研究却很少 1 。李巧如等通过研 究丁香提取物与各类抗菌素间的相互作用来探讨其抗菌 机理，推测丁香提取物的抗菌机理可能是与氨基糖苷类 竞争性地抑制蛋白质的合成 2 ；孙峋等对迷迭香酸的抗 菌机理进行研究，发现迷迭香酸可改变细菌细胞膜的通 透性，导致还原糖和蛋白质的渗漏而影响细胞代谢，通 过抑制 D N A聚合酶的活性而影D N A复制，从而发挥了 抑菌作用 3 。天然产物的抗菌机理多种多样，主要是基 于多种高选择性的效果，包括物理的、物理化学的和 生物化学的机理，通常是几种因素产生的积累效应。本 实验将在这方面做一些初步的研究和探索。丁香提取物 作用于大肠杆菌和单增李斯特菌后，检测细菌细胞A T P 含量、K+和 Na +含量、细胞裂解率的变化，结合透射 电子显微镜图，分析丁香提取物的抑菌机理。 1材料与方法 1 . 1材料与试剂 丁香购自哈尔滨市宝丰药店。 单增李斯特菌L . m o n o c y t o g e n e s ( N I C P B P 5 4 0 0 2 ) 和大 肠杆菌E . c o l i ( A T C C 2 5 9 2 2 ) 东北农业大学畜产品加工实 验 室 。 营养肉汤和琼脂培养基用于培养大肠杆菌( 3 7 ) ；T S B - Y E ( 胰酪胨大豆酵母浸膏肉汤) 和T S A - Y E ( 胰酪胨大豆酵母浸膏 琼脂) 培养基用于培养单增李斯特菌( 3 7 ) 。 丁香提取物的制备方法如下，首先将丁香于4 5 鼓 风干燥箱中烘干，超微细粉碎机捣碎后，称取 5 0 g 粉碎 干粉于5 0 0 ml 烧瓶中，加入4 0 0 ml 9 5 %食用酒精，置 5 5 恒温摇床( 1 0 0 r / mi n ) 1 2 h ，用Wh a t m a n N o . 2 滤纸过滤， 残渣加入2 0 0 m l 食用酒精重提1 2 h 后过滤。合并滤液在旋 转蒸发仪( 5 0 ) 中浓缩，取出浓缩液进行真空干燥( 4 0 、 0 . 0 7 MP a ) 得到丁香提取物，保存于2 0 冰箱中待用。 1 . 2方法 1 . 2 . 1A T P 测定 A T P 的测定参照张东声 4 、S i r a g u s a 5 和N a g h m o u c h i 6 方法，并稍加修改对数生长期的大肠杆菌于 1 4 8 0 g 离 89基础研究食品科学2009, Vol. 30, No. 03 心 1 5 mi n ，收集菌体，洗涤后的悬浊液溶于5 0 mmo l / L 、 p H6 . 0 MOP S 缓冲溶液中，测得其6 2 5 n m波长处的吸光 度为 0 . 0 2 。 添加葡萄糖到菌悬液中，使终浓度达到0 . 5 m m o l / L ， 5 mi n 后，取 1 0 0 l 样品加入 1 0 0 l 缓冲溶液，混合后 立即用 0 . 4 5 l 微量滤器过滤，滤液用于细胞外 A T P测 定，滤器上的细胞用于细胞内 AT P测定，测定结果用 作对照。 6 m i n 时，分别添加0 . 6 3 m g / m l 和1 . 2 5 m g / m l 的丁香提 取物到细胞悬浊液中，每隔 5 mi n ，取出 1 0 0 l 样品过 滤，滤器上的细胞中加入5 0 l 的细胞裂解液和5 0 l 的 荧光素，迅速搅动 3次后，置于微型荧光计中，1 0 s 后 的相对光单位( r e l a t i v e l i g h t u n i t s ，R L U ) 为胞内A T P 的含量。 取 5 0 l 滤液，加入5 0 l 的荧光素，迅速搅动3 次 后，置于微型荧光计中，相对光单位 R L U为胞外 A T P 的含量。 1 . 2 . 2细胞内离子流出的测定 对数生长期的大肠杆菌和单增李斯特菌于 4 下、 1 0 0 0 0 g 离心 1 0 mi n ，菌体细胞用 5 0 mmo l / L 、p H6 . 0 MOP S缓冲溶液洗涤两次，溶于含有 0 . 2 %葡萄糖的 MO P S 缓冲溶液中，分别添加0 . 6 3 m g / m l 和1 . 2 5 m g / m l 香 辛料提取物，3 0 下培养。每隔 5 mi n ，0 . 4 5 l 微量滤 器过滤后，采用原子吸收分光光度计，根据G B / T 5 0 0 9 . 9 1 0 0 3 的方法，测定 K +和 Na+ 的总量。 1 . 2 . 3细胞裂解率的测定 细胞裂解率的测定参照N a g h m o u c h i 6 方法稍加修改 测定：细菌培养6 h 后分离、洗涤、再悬浮于2 0 m m o l / L 、 p H6 . 0 的磷酸盐缓冲溶液中，分别添加 0 、1 . 2 5 、2 . 5 、 5 m g / m l 的丁香提取物到细胞悬浊液中，香辛料提取物和 菌悬液混合后，置于3 0 培养1 8 h ，紫外可见分光光度 计测定 6 5 0 n m处的吸光度。 1 . 2 . 4透射电镜扫描 单增李斯特菌和大肠杆菌在营养液中培养到A6 3 0 0 . 4 。取1 ml 菌液 1 0 0 0 0 g 下离心1 0 mi n 。倾去上清液， 加入 1 m l 0 . 0 6 3 m g / m l 和1 . 2 5 m g / m l 丁香提取物溶液，使 菌重新悬浮，3 7 下培养 2 0 mi n后，离心。细菌细胞 用 0 . 1 m o l / L p H 7 . 2 的磷酸缓冲液( P B S ) 清洗两次，用溶于 0 . 1 m o l / L P B S 的2 . 5 %戊二醛前固定。而后用溶于0 . 1 m o l / L P B S 的 1 % ( W/ V ) 的Os O4室温下后固定 2 h ，用相同的缓 冲液洗一次，再用乙醇逐级脱水，用环氧树脂包埋。 制备的样本用钻石刀在超薄切片机( S u p e r N o v a , R e i c h e r t - J u n g , Op t i s c h e We r k e A G Wi e n , A u s t r i l i a ) 上切片，并用饱 和的柠檬酸铅和醋酸铀双染后在日立H - 7 0 0 0 F A 透射电子 显微镜上观察，拍片。 2结果与分析 2 . 1细胞内离子流出的测定 从图 1 、2可以看出，因丁香提取物的作用，大 肠杆菌和单增李斯特菌在开始5 mi n 内迅速释放出 K +和 Na +，但 K的释放在 5 1 0 mi n 仍呈上升趋势，而后呈 现平稳趋势；大肠杆菌和单增李斯特菌 Na +的释放在 5 m i n 后基本呈现平稳趋势。不同浓度丁香提取物处理对 大肠杆菌和单增李斯特菌K +和N a+的释放影响显著，但 对 Na +的释放的影响高于对 K的释放。 2 5 0 2 0 0 1 5 0 1 0 0 5 0 0 K +流出量( n m o l / m g ) 时间( m i n ) 丁香提取物浓度为0 . 6 3 m g / m l 丁香提取物浓度为1 . 2 5 m g / m l 051 01 52 02 53 03 5 图1 不同浓度丁香提取物对大肠杆菌作用的钾钠离子流出量 Fig.1 K+ and Na+ efflux of E.coli under different concentrations of clove extract 6 0 0 5 0 0 4 0 0 3 0 0 2 0 0 1 0 0 0 N a +流出量( n m o l / m g ) 时间( m i n ) 051 01 5 2 02 5 3 0 3 5 丁香提取物浓度为0 . 6 3 m g / m l 丁香提取物浓度为1 . 2 5 m g / m l 2 5 0 2 0 0 1 5 0 1 0 0 5 0 0 051 01 52 02 5 3 03 5 K +流出量( n m o l / m g ) 时间( m i n ) 丁香提取物浓度为0 . 6 3 m g / m l 丁香提取物浓度为1 . 2 5 m g / m l 图2 不同浓度丁香提取物对单增李斯特菌作用的钾钠离子流出量 Fig.2 K+ and Na+ efflux of L.monocytogenes under different concentrations of clove extract 6 0 0 5 0 0 4 0 0 3 0 0 2 0 0 1 0 0 0 051 0 1 52 02 5 3 03 5 N a +流出量( n m o l / m g ) 时间( m i n ) 丁香提取物浓度为0 . 6 3 m g / m l 丁香提取物浓度为1 . 2 5 m g / m l 2009, Vol. 30, No. 03食品科学基础研究90 2 . 2细胞裂解率的测定 从图 3中可以看出，随着丁香提取物添加量的增 加，大肠杆菌和单增李斯特菌的细胞裂解率逐渐提高， 细胞裂解率与丁香提取物的浓度呈正相关。作用 6 h 和 1 8 h 的变化趋势是一致的。单增李斯特菌在6 h 和1 8 h 的 细胞裂解率均高于大肠杆菌，5 . 0 m g / m l 的丁香提取物对 单增李斯特菌作用6 h 的细胞裂解率为 2 1 . 5 3 %，作用1 8 h 的细胞裂解率为 5 0 . 4 %。 2 . 3A T P 含量测定 图4 丁香提取物对大肠杆菌胞内和胞外ATP的影响 Fig.4 Intracellular ATP (a) and extracellular ATP (b) levels of E.coli treated with different concentrarions of clove extract 图5 丁香提取物对单增李斯特菌胞内和胞外ATP 的影响 Fig.5 Intracellular ATP (a) and extracellular ATP (b) levels of L.monocytogenes treated with different concentrations of clove extract a . 胞内 A T P变化趋势图；b . 胞外 A T P变化趋势图。 从图 4 、5 可以看出，添加 0 . 5 mmo l / L葡萄糖后， 未经丁香提取物处理的大肠杆菌和单增李斯特菌胞内 A T P均呈稳定增加趋势。添加丁香提取物后，导致大 肠杆菌和单增李斯特菌胞内 A T P迅速下降，胞外 A T P 迅速增加。添加0 . 6 3 mg / ml 丁香提取物的大肠杆菌和单 增李斯特菌胞内 A T P呈现缓慢下降趋势，胞外 A T P含 量变化平缓；添加1 . 2 5 mg / ml 丁香提取物的大肠杆菌和 单增李斯特菌胞内A T P 含量在1 5 m i n 内迅速下降，然后 呈现缓慢下降趋势，胞外 A T P含量在 1 5 mi n 内迅速增 加，然后呈现波动趋势，这可能是由于 AT P在不断降 解的缘故。这个结果与 Wi n k o w s k i 等 7 、Na g h mo u c h i 等 6 的研究结果一致。这可能是由于丁香提取物抑制了 依赖于磷酸转移酶体系的磷酸烯醇式丙酮酸( P E P ) 的合 成，从而造成了胞内 AT P的缺失。 2 . 4透射电镜扫描 如图6 所示，未经处理的大肠杆菌细胞和单增李斯 特菌形态完整，经丁香提取物处理的大肠杆菌细胞和单 增李斯特菌的细胞膜破裂，内容物流出。细菌细胞中， 有些周围有细胞壁，而有些一边的细胞壁不明显，甚 至有些已破裂，内容物都流出，只剩了细胞壁的空壳， 表明细胞膜已受到了严重的破坏。透视电镜分析结果说 图3 不同浓度丁香提取物对大肠杆菌和单增李斯特菌作用6 h 和1 8 h 细胞裂解率 Fig.3 Lysis rates of E.coli and L.monocytogenes treated with different concentrarions of clove extract for 6 h and 18 h 2 5 2 0 1 5 1 0 5 00 0 . 6 31 . 2 52 . 55 6 h 细胞裂解率( %) 浓度( m g / m l ) 大肠杆菌 单增李斯特菌 大肠杆菌 单增李斯特菌 6 0 5 0 4 0 3 0 2 0 1 0 0 00 . 6 31 . 2 52 . 55 1 8 h 细胞裂解率( %) 浓度( m g / m l ) 4 5 0 0 0 0 4 0 0 0 0 0 3 5 0 0 0 0 2 5 0 0 0 0 2 0 0 0 0 0 1 5 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 5 0 0 0 0 0 05 1 0 1 5 2 0 2 53 0 3 5 R L U s 时间( m i n ) 对照 丁香提取物浓度为0 . 6 3 m g / m l 丁香提取物浓度为0 1 . 2 5 m g / m l a a . 胞内 A T P变化趋势图；b . 胞外 A T P变化趋势图。 4 0 0 0 0 0 3 5 0 0 0 0 3 0 0 0 0 0 2 5 0 0 0 0 2 0 0 0 0 0 1 5 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 5 0 0 0 0 0 05 1 0 1 5 2 0 2 53 0 3 5 R L U s 时间( m i n ) a 对照 丁香提取物浓度为0 . 6 3 m g / m l 丁香提取物浓度为1 . 2 5 m g / m l 时间( m i n ) 05 1 0 1 5 2 0 2 53 0 3 5 4 0 0 0 3 5 0 0 2 5 0 0 2 0 0 0 1 5 0 0 1 0 0 0 5 0 0 0 R L U s b 丁香提取物浓度为0 . 6 3 m g / m l 丁香提取物浓度为1 . 2 5 m g / m l 丁香提取物浓度为0 . 6 3 m g / m l 丁香提取物浓度为1 . 2 5 m g / m l 1 6 0 0 1 4 0 0 1 2 0 0 1 0 0 0 8 0 0 6 0 0 4 0 0 2 0 0 00 5 1 0 1 5 2 0 2 53 0 3 5 R L U s 时间( m i n ) b 91基础研究食品科学2009, Vol. 30, No. 03 图6 丁香提取物处理5 m i n 的大肠杆菌和单增李斯特菌电镜观察 B a r = 2 0 0 n m Fig.6 Transmission electron microscope images of Escherichia coli (A.original; B.treated with 0.63mg/ml of clove extract; C. treated with 1.25mg/ml of clove extract) and Listeria monocytogenes (D.original; E.treated with 0.63mg/ml of clove extract; F.treated with 1.25mg/ml of clove extract) after treatment with clove extract for 5 min A . 未处理的大肠杆菌；B . 0 . 6 3 mg / ml 丁香提取物处理的大肠杆菌； C . 1 . 2 5 mg / ml 丁香提取物处理的大肠杆菌；D. 未处理的单增李斯特菌； E . 0 . 6 3 mg / ml 丁香提取物处理的单增李斯特菌；F . 经1 . 2 5 mg / ml 丁香提取 物处理的单增李斯特菌；B a r = 2 0 0 n m。 明丁香提取物部分作用机理，如细胞壁疏松、膜密度 降低、细胞内容物减少、干扰蛋白质和细胞壁的合成。 3结 论 综上所述，丁香提取物快速杀死大肠杆菌和单增李 斯特菌的原因主要是破坏了其细胞膜。 参考文献： 1 H OL L E Y , R A , P A T E L D. I mp r o v e me n t i n s h e l f - l i f e a n d s a f e t y o f p e r i s h a b l e f o o d s b y p l a n t e s s e n t i a l o i l s a n d s mo k e a n t i mi c r o b i a l s J . F o o d Mi c r o b i o l o g y , 2 0 0 5 , 2 2 : 2 7 3 - 2 9 2 . 2 李巧如, 刘宗智, 任健康, 等. 丁香提取物抗菌机理的探讨 J . 西北 药学杂志, 2 0 0 1 , 1 6 ( 6 ) : 2 6 1 - 2 6 2 . 3 孙峋, 汪靖超. 迷迭香酸的抗菌机理研究 J . 青岛大学学报: 自然科 学版, 2 0 0 5 , 1 8 : 4 1 - 4 5 . 4 张东声, 王春生, 杨俊毅, 等. 荧光法测定微型生物细胞内的A T P 的 技术 J . 海洋学研究, 2 0 0 6 , 2 4 ( 1 ) : 7 3 - 8 1 . 5 S I R A GU S A G, C U T T E R C N, DOR S A W J , e