第4章-蛋白质一级结构测定

第四章蛋白质结构测定,数年后，美国科学家Moore和Stein改进了Sanger的方法，完成了第一个酶蛋白核糖核酸酶的序列分析。,1955年英国科学家FSanger发表了胰岛素的全部氨基酸排列顺序，开创了研究蛋白质一级结构的新纪元。这是分子生物学发展进程中的一个重要突破。,第四章蛋白质一级结构测定,第一节蛋白质序列测定的基本策略和步骤,第二节蛋白质和肽的氨基酸组成分析,第三节末端氨基酸的测定,第四节肽链的专一性水解和肽段的分离纯化,第五节肽段的序列测定,第六节由已知序列肽段建立蛋白质一级结构,第七节蛋白质一级结构研究进展,第一节蛋白质序列测定的基本策略和步骤,一、序列测定的基本策略,二、序列测定前的准备工作,三、序列测定的一般步骤,一、序列测定的基本策略,两种或两种以上的特异性裂解法,2.逐级特异性裂解,战略考虑关键一是多肽链片断裂解方法的选择；二是裂解后肽段的分离纯化；三是要寻找接头肽段。,二、序列测定前的准备工作,（一）样品的纯度要求（二）蛋白质的分子量测定（三）构成蛋白质的多肽链的数目和大小（四）蛋白质的氨基酸组成（五）蛋白质的配基（六）蛋白质的末端分析,蛋白质一级结构测定(重点),指蛋白质多肽链中氨基酸的排列顺序以及二硫键的位置。测定的基本步骤：（一）测定蛋白质纯度、分子量和浓度（二）进行末端分析，确定蛋白质的肽链数目及N-端和C-端氨基酸的种类（三）拆开二硫键并分离出每条多肽链（四）分析每条多肽链的N-末端和C-末端残基组成和摩尔数（五）用两种不同方法将肽链专一性地水解成两套肽段并进行分离，以获得单一的碎片（六）比较各个肽段的氨基酸排列顺序并拼凑出完整肽链的氨基酸排列顺序（七）二硫键和酰胺基位置的确定,（一）样品的纯度要求,一般要求纯度在97以上，杂蛋白含量超过5时便很难测定序列。常用来检测蛋白质样品均一性的方法有：双向分析电泳；变性聚丙烯酰氨凝胶电泳；离子交换层析；N末端氨基酸的测定；亲和层析；纯化至恒定比活；肽（酶）谱分析；Western印渍法等。,（一）测定蛋白质纯度、分子量和氨基酸组成,1、样品的纯度与分子量纯度97%；测定方法：（1）SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-polyacrylamidegelelectrophoresis，SDS-PAGE）凝胶知识丙烯酰胺（acrylamide），甲叉双丙烯酰胺（methylenebisacrylamide）聚合而成；凝胶孔径：选择丙烯酰胺浓度，甲叉双丙烯酰胺胶联剂的浓度；凝胶有分子筛效应。,SDS-PAGE,SDS（sodiumdodecylsulfate）阴离子洗涤剂，几乎能破坏天然蛋白质中所有的非共价键，从而使多亚基蛋白质解聚，并使多肽链呈伸展状态，消除了蛋白质形状对迁移率（migrationrate）的影响；SDS以1:2的比例与肽链中的氨基酸残基结合，使变性蛋白质带上大量的净负电荷，而且电荷量与蛋白质分子量（即肽链长度）成正比。所以分子量成为决定蛋白质迁移率的唯一因素。,SDS-PAGE,SDS-PAGE分离的蛋白质可以用Coomassieblue染色，也可银染（silverstain）SDS-PAGE能分离分子量差异小于10%的蛋白质用于蛋白质纯化和分子量近似值测定,（2）等电聚焦（isoelectricfocusing，IEF）,在凝胶上加入一种两性电解质（ampholyte），电泳时会形成连续的pH梯度电泳后，各种蛋白质停留在与其等电点（pI）相同的位置IEF能分离pI值仅相差0.01的蛋白质（即一个净电单位）,不连续电泳的三种效应：浓缩效应，分子筛效应电荷效应,（3）双向电泳（two-dimensionalgelelectrophoresis）,双向电泳=IEF+SDS-PAGE第一向：根据电荷差异用IEF分离第二向：根据分子量差异用SDS-PAGE分离,每一个点代表一条多肽链，每一条多肽链有自己的等电点和分子量。多肽链可以用染色法或放射自显影进行检测,（4）其它方法,离子交换层析（根据物质所带电荷进行分离）亲和层析（利用蛋白质与与其他分子的结合特异性）末端氨基酸测定纯化至恒定比活肽（酶）谱分析Western印迹法（由蛋白质的SDS-PAGE、电转及杂交几部分组成）,2、浓度测定,紫外吸收法蛋白质（ug/ml）（1.45A280一0.74A260）X稀释倍数显色法双缩脲法：Cu2+与蛋白质的肽键，以及酪氨酸残基络合，形成紫蓝色络合物，此物在540nm波长处有最大吸收。双缩脲法常用于0.5g/L10g/L含量的蛋白质溶液测定。干扰物有硫醇，以及具有肽性质缓冲液，如Tris、Good缓冲液等。可用沉淀法除去干扰物，即用等体积10%冷的三氯醋酸沉淀蛋白质，然后弃去上清液，再用已知体积的1mNaOH溶解沉淀的蛋白质进行定量测定,Lowry法,即Cu2+与蛋白质在碱性溶液中形成络合物（双缩脲反应），然后这个络合物还原磷钼磷-磷钨酸试剂（福林-酚试剂），结果得到深蓝色物，于nm下达到最大吸收峰。此法比双缩脲法灵敏得多，适合于测定20mg/L400mg/L含量的蛋白质溶液。干扰物质与双缩脲法相同，而且受他们的影响更大,考马斯（Comessie)亮蓝结合法,原理：考马斯亮兰能与蛋白质的疏水微区相结合，这种结合具有高敏感性，考马斯亮兰G-250的最大光吸收峰在465nm，当它与蛋白质结合形成复合物时，其最大吸收峰改变为595nm。微量法测定蛋白含量范围为1-10g；常量法测以检测范围10-100g为宜干扰物质较少,（二）蛋白质的分子量测定,常用的测定方法有：渗透压（osmoticpressure）2.沉降平衡（sedimentationequilibrium）3.凝胶过滤法；4.SDS聚丙烯酸胺凝胶电泳法5.激光解吸电离飞行质谱法,分子量测定,公式：/c=RT/M+Kc,.渗透压（osmoticpressure）,：渗透压c：溶质浓度R：气体常数T：绝对温度M：分子量,同时测定几个不同浓度的渗透压，以/c对c作图并外推到蛋白质浓度为零，得截距，从而求出M。为避免pH值的影响，在溶解度允许的范围内，尽量采用等电点或接近等电点的缓冲液，并增加溶液中无机盐的浓度。可以测分子量在110万范围的蛋白质。实验装置简单，准确度高。但不能区别溶液中蛋白质分子是否均一。,.沉降平衡（sedimentationequilibrium）,用较低的速度离心（8,00020,000r/min）离心开始后，颗粒发生沉降，造成浓度梯度，同时产生扩散作用。扩散力与离心力作用方向相反，相互平衡,1,B为斜率，A为截距。当条件一定时，B与A均为常数,2,B为斜率，A为截距。当条件一定时，B与A均为常数,3,分子,（三）构成蛋白质的多肽链的数目和大小,若肽链之间非共价交联，可用高浓度变性剂（如8molL尿素或6molL盐酸胍）变性拆离2.若肽链是由二硫键共价交联，可用过量的巯基乙醇等断裂二硫键，同时加变性剂，并保护生成的巯基,拆开二硫键方法之一过甲酸氧化法,为避免副反应，一般在10下进行反应，但Trp仍被破坏，Met氧化成亚砜。此法的优点是，切断二硫键后，不能重新形成二硫键，便于肽键分离。,用得最多的还原剂是巯基乙醇、巯基乙酸、二硫苏糖醇、连四硫酸钠等。为使反应完全，还原剂要过量，同时在反应体系中加入变性剂（SDS、脲、胍等）。在烷基化之前，还原的巯基要用N2保护。用碘乙酸（或其酰胺），环乙烯亚胺封闭新生成的巯基，使巯基烷基化避免二硫键重新形成。,巯基保护还原-羧甲基化法,(四)蛋白质的氨基酸组成（五）蛋白质的配基（六）蛋白质的端基分析,三、序列测定的一般步骤,正常的序列测定包括以下步骤：先是根据肽段大小和氨基酸组成情况选择合适的裂解肽段试剂，将多肽链裂解成一系列小肽，并分离纯化这些小肽段；然后测定每一肽段的氨基酸序列；2.另取一份样品，用第二种方法裂解多肽链（切点位置与第一次不同），分离纯化各肽段后，测每一肽段的氨基酸序列；3.最后比较已测得的两套肽段的序列，找出前后两次断裂点相重叠的部位，即接头部位，即可排出多肽链完整的氨基酸排列顺序。对于一次不能连续测出序列的大肽段，还需继续裂解成小肽，并分离纯化，分别测出这些次级肽段的序列。若多肽链含有二硫键或其它配基，如酰胺基时，还需分别确定它们在序列中的连接位置。,第二节蛋白质和肽的氨基酸组成分析,一、蛋白质的水解,二、氨基酸的分离和定量测定,三、特殊氨基酸的测定,一、蛋白质的水解,（一）盐酸水解法（二）磺酸水解法（三）酶水解法,能较满意地得到除Trp和Cys以外的其它所有氨基酸,（一）盐酸水解法,盐酸水解是目前水解蛋白质或多肽应用最广泛的一种方法。用此法能较满意地得到除Trp和Cys以外的其它所有氨基酸，方法也较为简便。存在的问题,使用重蒸5.7molL恒沸点盐酸，在密封的水解管中，于105110进行蛋白质水解。水解时间一般在2472小时。结果，大部分氨基酸可定量回收；但是，Trp基本上全被破坏，必须用其它方法测定；Ser和Thr缓慢分解，要准确测定，需要做几个水解时间实验；含Val和Ile的肽键，由于支链的空间障碍而水解缓慢，所以，定量测定就要长时间水解；Cys可被部分破坏和氧化，所以最好在氧化成稳定的磺基丙氨酸后测定；Gln和Asn在酸水解时脱酰胺后全部变成Glu和Asp，水解时放出的氨量可用来测定Asn和Gln的总量，或者用不水解酰胺的方法水解肽键后直接测定。,盐酸水解时，Met易被氧化转变为甲硫氨酸砜，损失约20左右，可以用这一数值进行校正，也可用保护剂（在盐酸中加入0.l1.0巯基乙酸）来减少水解中Met的损失;Tyr的破坏率约为10，如水解时加入0.l1.0巯基乙酸和0.050.l苯酚，能使Tyr和Ser回收率明显提高，这时Met也能免遭破坏。,碱水解一般用5mol/L氢氧化钠煮沸10-20小时。由于水解过程中许多氨基酸都受到不同程度的破坏，产率不高。部分的水解产物发生消旋化。该法的优点是色氨酸在水解中不受破坏。,（二）磺酸水解法,用4molL甲基磺酸，内含0.2吲哚基乙胺（色胺）作水解剂，可使Trp的回收率达到90以上，Ser和Thr的回收率接近定量值。其中Cys可用二硫苏糖醇还原水解液中的胱氨酸及其衍生物，然后用过量的连四硫酸钠氧化，得到S磺基半胱氨酸而加以测定。,磺酸水解也有局限性，当水解液中存在碳水化合物时，色氨酸容易破坏，因此对含有较多碳水化合物的糖蛋白分子不能用本方法测定色氨酸。本法的最大优点是中性水解液可直接上机，色氨酸较稳定,（三）酶水解法,选用专一性低，水解酶活力高的蛋白酶水解。主要缺点：不易达到彻底水解，影响氨基酸的回收率；蛋白酶自溶产物会污染水解的氨基酸混合物。,目前用于蛋白质肽链断裂的蛋白水解酶或称蛋白酶（proteinase）已有十多种。应用酶水解多肽不会破坏氨基酸，也不会发生消旋化。水解的产物为较小的肽段。,二、氨基酸的分离和定量测定,当前使用最普遍、最有效的是以离子交换层析法为基础研制的氨基酸自动分析仪，也有用HPLC的。使用的柱材料是磺酸型聚苯乙烯阳离子交换树脂。在pH2.0的条件下，全部氨基酸都能牢固地结合在树脂上。提高洗脱液的pH和离子强度，可将氨基酸依次洗脱下来，从而达到分离的目的。,洗下的氨基酸与茚三酮反应形成紫色产物Ruheman紫，可于570nm比色测定。但Pro与茚三酮反应形成的产物为黄色，于440nm比色测定。,分离,定量测定,17种标准氨基酸混合液在日立83550型氨基酸自动分析仪上的分析图谱,三、特殊氨基酸的测定,（一）色氨酸（Trp）的测定（二）巯基测定（三）二硫键的测定（四）氨基的测定,（一）色氨酸（Trp）的测定,1紫外吸收法2对二甲基氨基苯甲醛法Trp在强酸条件下与醛反应生成带色产物。颜色的深浅与Trp含量成直线关系。该带色物质的最大吸收峰位在590nm。该法已广泛采用，结果较可靠。,返回,由于Trp和Tyr在280nm和290nm的紫外区有光吸收，因此可用完整的蛋白质样品进行Trp测定。先将蛋白质样品溶于6molL盐酸胍溶液中，然后分别在280nm和288nm测量蛋白质溶液的光吸收。Trp在288nm和280nm的摩尔消光系数分别是4815和5690；而Tyr在288nm和280nm的摩尔消光系数分别是385和1280。根据测定混合物中两种物质浓度的比尔定律，可得两个联立方程，稍加整理，则可得到Trp与Tyr之比：,回上页,（二）巯基测定,测定巯基的主要方法有形成硫醇盐法，烷基化法和比色法。比色法简单易行。这类方法是根据试剂与巯基反应后生成带色产物来进行测定的。5.5二硫代双（2硝基苯甲酸）（DTNB）测定法反应后产生4硝基3羟基硫酚，可用半胱氨酸作标准样品，在412nm处测定2.萘醌测定法萘醌与巯基有当量加成关系，加成物在420nm左右有吸收峰、标准物和未知物在相同条件下测定。,返回,（三）二硫键的测定,1Ellman试剂法当有一游离巯基存在时，Ellman试剂（结构类似于DTNB）可与二硫键发生反应，而进行测定22硝基5硫代苯磺酸法（NTSB）过量亚硫酸钠与蛋白质反应可裂解蛋白质中的二硫键，而进行测定,返回,拆开-S-S-的方法,（1）二硫键的断裂几条多肽链通过二硫键交联在一起，可在8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍存在下，用过量的-巯基乙醇处理，使二硫键还原为巯基，然后用烷基化试剂保护生成的巯基，以防止它重新被氧化。,（2）二硫键的切割与保护,切割过甲酸performicacid不可逆，还原氧化不可逆巯基乙醇，DTT碘乙酸S-CH2-COOH亚硫酸分解Sulfitolysis可逆R1-S-S-R2HSO3-R1-S-+R2-S-SOH3,（四）氨基的测定,1.常用2，4，6三硝基苯磺酸（TNBS）进行测定，此法比较灵敏。在温和条件下试剂即能与伯胺定量反应，产物可用分光光度法定量测定。2.采用荧光胺测定氨基，灵敏度大为提高，可测定pmole数量级的氨基。产生的荧光团可在390nm被激发，在475nm发出荧光。荧光强度与伯胺浓度成正比。肽在pH7能产生最大的荧光强度。荧光胺反应的一个优点是游离氨的干扰极微。3.用邻苯二醛2-巯基乙醇测定伯胺，比荧光胺的灵敏度高510倍。试剂与伯胺生成强荧光产物，可在340nm被激发，在455nm测量荧光。,返回,第三节末端氨基酸的测定,一、N末端的测定,二、C末端的测定,一、N末端的测定,N端测定法（除氨肽酶外）的共同特点是在N端引入具有一定基团的标记化合物。这种标记基团有颜色，荧光，紫外吸收等性质，然后分离鉴定具有这种基团的氨基酸衍生物。,（一）二硝基氟苯法（二）丹磺酰氯分析法（三）异硫氰酸苯酯法（四）DABITC法（五）氨肽酶法（六）封闭N端的测定,1950年提出的，也称Edman降解法，其最大优点是可以连续降解，见第五节,原理类似于Edman降解反应。检出灵敏度可靠，见第五节,（一）二硝基氟苯法,黄色DNP氨基酸衍生物，可用乙醚抽提,DNP-氨基酸见光易分解，整个操作应在暗处进行,检测不出DNP氨基酸的可能原因,被分析对象的N端是封闭的,因为DNPPro或DNPGly在盐酸水解条件下极不稳定，回收率甚低。这时要缩短水解时间,N端为Pro或Gly,末端残基很可能是Val、Ile,如焦谷氨酰基，乙酰基等,它们所形成的肽键对酸水解的耐性强，酸水解后没有产生游离的DNP氨基酸，而生成DNP小肽，可通过延长水解时间来解决这个问题,（二）丹磺酰氯分析法,反应产物DNSAA在紫外线下有强烈荧光，检测灵敏度可达1091010摩尔，比二硝基氟苯法高100倍。,荧光试剂,该反应依赖pH，并需过量DansylCl试剂。His的咪唑基、Cys的巯基、Tyr的酚基和Lys的氨基等也能和试剂反应，生成相应的衍生物，但这些物质不影响N端DNS氨基酸的测定。,（六）封闭N端的测定,N端残基受封闭的种类很多，例如乙酰化（兔肌红蛋白）、甲酰化（蜂毒素）、焦谷氨酰环化（兔免疫球蛋白）、丙酰氨环化及个别多肽形成的环状分子（短杆菌酪肽A）等。前三种常见。,除了自然界中许多蛋白质或活性多肽以N端氨基封闭的形式存在以外。在一定条件下，Gln（无论是游离的还是处在肽链N端）会发生环化反应，形成焦谷氨酰基衍生物：,目前降解N末端焦谷氨酰残基的方法有酶解法和化学降解法两种,！封闭端的测定,种类、乙酰化（兔肌红蛋白）；、甲酰化（蜂毒素）；、焦谷氨酰环化（兔免疫球蛋白）；、丙酰氨环化及个别多肽形成的环状分子（短杆菌酪肽）等,对于、，可采用温和酸水解，对还可采取来自大肠杆菌的脱甲酰酶除掉；对可采取以下两种方法焦谷氨酰氨肽酶（可专一裂解焦谷氨酰末端）；化学降解（盐酸甲醇试剂）,酶解法,焦谷氨酰氨肽酶，此酶可专一裂解焦谷氨酰N末端，是裂解N末端焦谷氨酰残基肽的最有用的办法。此酶已有商品出售。,化学降解,用盐酸甲醇试剂。在温和条件下，该试剂能打开焦谷氨酰残基的吡咯烷酮环，暴露其氨基。暴露的氨基则能被Edman试剂偶合，然后按正常方法降解。用本法降解焦谷氨酰残基，操作简便，效率较高，开环产率达90，试剂便宜，是一条优于酶法降解的较好途径。,N端甲酰基可通过温和酸水解法除去，而不致引起肽键严重裂解，或者用来自大肠杆菌的脱甲酰基酶除掉。,二、C末端的测定,C末端残基的测定比N端残基测定困难。可供选用的方法比较少。化学法中有肼解法、乙内酰硫脲法、C末端选择性氚标记法，减数C末端测定法和还原法。酶法中有羧肽酶法。（一）肼解法（二）C末端选择性氚标记法（三）减数C末端测定（四）还原法（五）羧肽酶法,（一）肼解法,蛋白质,无水肼,100,510h,+,氨基酸的酰肼,肼解下来的C端氨基酸借助DNFB试剂及分级抽提等方法，再以层析技术可迅速鉴定出种类和数目。C端为半胱氨酸和胱氨酸的肽，不能用肼解法测定，因为这两种氨基酸在肼解时分解，必须先氧化或烷基化后再肼解测定。,第一步,第二步,第三步,第四步,醋酸酐处理多肽，形成C端酮环,打开噁唑酮环,C端氨基酸的碳原子已被氚（3H）标记,酸水解，分离鉴定氚标记的氨基酸,（二）C末端选择性氚标记法,碱催化噁唑环消旋反应，将氚引入噁唑酮环,注：不适于C端为Pro和Asp,（三）减数C末端测定,此法是先将肽样品的N端固定在多孔玻璃球上，然后用二P硝基苯磷酸酰迭氮化合物（dipnitrophenylphosphorylazide）处理，使C端羧酸基团转为相应的酰迭氮化物，随后再将酰迭氮化物热解成异氰盐。产物经酸水解后，使C末端残基破坏。这样可通过测量反应前后的氨基酸组成变化来确定C末端残基。因此，它类似于减数Edman降解法，反应式如下：,仅适用于小肽，且对样品的消耗大，测一个C末端残基约损耗90%以上,（四）还原法,用硼氢化锂将C末端氨基酸还原成相应的氨基醇。随后将此肽完全水解。水解物中将含有一个相当于原来的C末端氨基酸的氨基醇分子，可用色谱法鉴别。Sanger早年就是用此法鉴定胰岛素A、B链的C端。,（五）羧肽酶法,此法是有效方法也最常用。羧肽酶是一类外肽酸，能专一地从肽链的C末端开始逐个降解，释放出游离氨基酸，反应如下：,释放出的氨基酸数目和种类随时间发生变化。可用自动氨基酸分析仪作定性和定量测定，然后根据氨基酸释放的动力学曲线，即以时间为横坐标，释放的氨基酸量为纵坐标作图，便可确定该肽链的C端氨基酸的序列。,C端顺序是ThrValPhe,但是，由于羧肽酶对不同侧链基团有极不相同的亲和性，所以实际情形要复杂得多，有时结果难于解释。但可采取一些步骤使释放不同羧基末端的速度更平稳。例如在变性剂存在下使用羧肽酶。羧肽酶在稀SDS或6molL脲中是有活性的，由于变性剂破坏了蛋白质的二、三级结构，因而使不同羧基末端的释放速度趋于相近。反应pH也影响释放速度。当pH低至足以抑制羧基上的正电荷时，释放速度加强。此外有可能以稳定的活性形式固定化羧肽酶，这可显著提高C端测定的利用率。目前至少有4种不同的羧肽酶可供利用。下表列出了这些酶的来源，反应条件及专一性。,表四种羧肽酶的性质及其降解条件,第四节肽链的专一性水解和肽片断的分离纯化,一、肽链的专一性水解（一）蛋白质的化学裂解1.溴化氰裂解2.BNPSSkatole法3.亚碘酰基苯甲酸裂解法4.XCys键的裂解5.羟胺裂解6.AspPro键的裂解（二）蛋白质的酶法裂解二、肽段的分高纯化及纯度鉴定（一）肽段的分离纯化（二）肽段的纯度鉴定,MetX,AsnGly,一个标准：纯肽只有一个N端,一、肽链的专一性水解,裂解时有两个问题必须注意一、要求裂解点少，专一性强、收率高二、与二硫键相关,方法基本上分两大类：一、化学法二、酶法,回节目录,（一）蛋白质的化学裂解,化学法裂解的肽段一般较大，适于在自动序列分析仪中测定序列，同时有利于肽段的吻合，所以化学法对较大分子量的蛋白质的序列测定是很重要的。下面介绍最常用的化学裂解法。,l溴化氰裂解,溴化氰能专一裂解蛋氨酸残基的羧端肽键，产率达到85。溴化氰与蛋白质中蛋氨酸侧链硫醚基反应，生成溴化亚氨内酯，此产物与水进一步反应，将肽键断裂，反应如下图所示：,溴化亚氨内酯,反应在酸性介质中进行。此时巯基也能发生反应，但不切断肽链。若事先用烷基化试剂保护巯基，可防止此反应发生。,注意：Ser、Thr干扰；AspPro,蛋白质一般含Met较少，所以溴化氰裂解蛋白质能得到大的肽段。Met如被氧化成砜或亚砜，则不能发生裂解反应，所以整个反应要在氮气容器中进行。溴化氰相对Met要过量50100倍（摩尔比），反应时间通常24小时。,2.BNPSSkatole法,在酸性介质中，用溴化剂裂解多肽已经多年了。例如，N溴琥珀酰亚胺（NBS）可在不同部位裂解多肽，包括Trp、Tyr、His等部位，但常有副反应，产生不溶物。BNPSskatole是一种温和的氧化剂和溴化剂。该试剂对Trp裂解的专一性比NBS高，产率通常在5070，缺点是试剂不太稳定，对光敏感，所以反应要在暗处进行。它可在Trp残基的羧基一侧裂解肽键。蛋白质中一般含Trp极少，所以这是一个很有用的裂解方法。Met和Tyr也能与该试剂作用，但Met在反应结束后可用还原剂（巯基乙醇）再生，而与Tyr的反应可用加入过量Tyr来避免。,BNPSskatole的结构式,返回,3.亚碘酰基苯甲酸裂解法,此试剂可在相当温和条件下裂解TrpX肽键，产率可达70100。反应机理是氧化吲哚环。蛋白质溶在4molL盐酸胍（用80醋酸液配制）中，再加甲酚并与该试剂于室温暗处反应24小时，过量试剂用DTT破坏。注意要用纯化的亚碘酰基苯甲酸，因为污染物碘酰基苯甲酸可在TyrX处裂解，也能在HisX键上裂解。甲酚的功能是清除残余的碘酰基苯甲酸，改善裂解选择性。,4.XCys键的裂解,有两种试剂可用于裂解含Cys残基的肽：2硝基5硫氰苯甲酸（NTCB）和（2甲基）Nl苯磺酰N4（溴乙酰）醌二亚酰胺（也称为Cyssor，因专一性剪切半胱氨酸而得名）。这两种试剂都是在半胱氨酸的N端侧发生裂解。裂解产率大于90。,5.羟胺裂解,羟胺能专一裂解AsnGly间的肽键，其反应机理是，通过羟胺作用先形成一个琥珀酰亚胺环状物，最后导致AsnGly键的裂解。,在蛋白质氨基酸序列分析中，AsnGly键出现的几率是很低的，所以用此法降解产生的肽段都很大，这对分子量大的蛋白质的测定是十分有用的,6.AspPro键的裂解,蛋白质中的AspPro键对酸特别不稳定，在稀酸条件下，AspPro键就能断裂。合适的反应条件是：蛋白质（5mgmL）溶在10醋酸中，用吡啶调pH2.5，于40保温25天。在这样的条件下，AspPro键相对于其它含Asp的肽反应性加强，是由于Pro中亚氨基环的碱性较大引起的。反应过程略。有人发现，pH2.5时，羟胺也能裂解AspPro键，产率达到80。有人做过统计，每841个残基中，AspPro键出现的几率为l2，实际上常达到34。,（二）蛋白质的酶法裂解,用酶解法裂解肽键要考虑的几种因素,合适的pH；适宜的反应温度；恰当的蛋白质与酶的比率；选择相应的反应时间；待裂解蛋白质的物理状态。,胰蛋白酶,胰凝乳蛋白酶,胃蛋白酶,嗜热菌蛋白酶,枯草杆菌蛋白酶,Lys侧链经琥珀酰化后，能抵抗胰蛋白酶裂解。环己二酮保护肽链中的Arg，用羟胺处理后，可去掉保护基、恢复成Arg。亚乙基胺修饰Cys，则产生S氨乙基Cys，它是Lys侧链的类似物，可被胰蛋白酶识别。,返回,Pepsin：R1和R2苯丙氨酸(Phe),色氨酸(Trp),酪氨酸(Tyr);亮氨酸(Leu)以及其它疏水性氨基酸水解速度较快。R1不能为Pro。,胃蛋白酶,thermolysin：R3=Phe,Trp,Tyr;Leu，Ile,Met以及其它疏水性强的氨基酸水解速度较快。R2和R4不能为Pro。,嗜热菌蛋白酶,酸性磷酸酶、弹性蛋白酶也较常用,分离的原理：根据肽段的物化特性，包括分子大小、电荷、极性、溶解度以及特殊的共价或非共价结合等性质。,（一）肽段的分离纯化,常用于检测含巯基、甲硫氨酸、赖氨酸的肽段和胰蛋白酶降解后的C端肽段。,对角线法(Hartlay),两个方向上的条件相同,两个方向上的条件不同，二硫键被还原,检测手段,分离及检测效率的提高,传统层析分离技术,高效液相色谱（HPLC）及质谱,第五节肽段的序列测定,一、手工序列测定技术（一）Edman化学降解法（二）DNSEdman序列分析法（三）减数Edman序列分析法（四）DABITCPITC双耦合法（五）酶学降解测定肽序列二、自动序列分析（一）液相序列仪（二）固相序列仪（三）气相序列仪,异硫氰酸苯醋,异硫氰酸苯酯肽,2苯胺基5噻唑啉酮衍生物,3苯基2乙内酰脲,（一）Edman化学降解法,（二）DNSEdman序列分析法,荧光检测，灵敏度比Edman法高几倍甚至十几倍；用酸高温水解，使Gln和Asn相应地变成Glu和Asp，而且不能检出色氨酸。,（三）减数Edman序列分析法,将肽链中的N端氨基酸残基逐次从肽链中除去，并随之分析相应肽链的氨基酸组成，从每一循环中氨基酸的丢失或减少，可以推出N端氨基酸的排列顺序。适用于小肽。少于1015个残基的小肽可用本法来测定序列。,（四）DABITCPITC双耦合法,DABITC是一种改进的Edman试剂（4N,N二甲基氨基偶氮苯4异硫氰酸酯）。,最后生成有明显颜色的二甲氨基偶氮苯硫氰酯氨基酸（DABTH氨基酸）。经盐酸蒸气熏即能显示红色斑点，而杂质与试剂反应物显蓝色或紫色斑点。提高了检测的灵敏度和准确性，只要用pmol样品即可鉴定。,+PITC,双耦合,DABITC：4N,N二甲胺基偶氮苯4异硫氰酸醋（4-N,N-dimethylaminoazobenzene-4-isothiocyanate）DABTC：4N,N二甲胺基偶氮苯4硫代氨甲酰基（4-N,N-dimethylaminoazobenzene-4-thiocarbamoyl）DABTZ：4N，N二甲胺基偶氮苯4噻唑啉酮氨基酸（4-N,N-dimethylaminoazobenzebe-4-thiozolinone-aa）DABTH-aa：4-N,N-二甲胺基偶氮苯-4-乙内酰硫脲-氨基酸（4-N,N-dimethylaminoazobenzehe-4-thiohydantoin-aa）,（五）酶学降解测定肽序列,1氨肽酶法2羧肽酶法3外肽二肽酶测定肽序列,1氨肽酶法,氨肽酶是专一性从N端逐个降解蛋白质或多肽的一类外肽酶。最常用的是亮氨酸氨肽酶（LAP）。在N端的第二个氨基酸是Pro时，则此酶不能将N端水解下来。此外，所有肽键都能被LAP水解，但水解速度变化很大、N端为极性氨基酸和芳香族氨基酸时，水解速度慢；N端为疏水侧链较大的氨基酸（如Leu）时，水解速度最快。各类氨肽酶及其专一性列于下表中。,2羧肽酶法,常用的羧肽酶有三类：A、B、C。其中羧肽酶A最为常用。但用它也只能确定45个氨基酸残基序列。,3外肽二肽酶测定肽序列,二肽氨肽酶、二肽羧肽酶,（一）液相序列仪,液相序列仪主要采用了自旋式反应器，在其中可以有效地进行反应和充分抽提，适宜于较大片断的分析。应用5nmol样品，可以连续测定2050个左右的残基，收率为97%以上。液相序列仪的主要缺点是不适于分析小肽，因为小肽在有机溶剂中溶解度大，易于从反应杯中洗出。若将小肽固定在载体上，再进行Edman降解则可克服这个缺点，于是产生了固相序列测定仪。,（二）固相序列仪Laursen1971,对一般的小肽（少于30个残基的肽），甚至是疏水性肽都能进行序列分析。固相法是先将肽段共价结合到一种惰性载体上，并装成柱，然后按一般的Edman降解程序从N端逐级降解。,缺点是，肽链共价结合到载体上的收率较低，有时低到2030，所以肽与载体的偶联方法及载体的开发仍是目前要解决的问题。,（三）气相序列仪Hewick1981,适应微量序列分析的需要，也称气液固相序列仪（GasLiquidsolidphaseSequenator）。,特点是弹筒型的反应室代替了液相序列仪中的旋转玻璃杯，反应试剂是在气态下完成蛋白质的Edman降解反应。,气相序列仪的明显优点是：灵敏度高，作为序列测定的多肽量最低在5pmol水平；试剂和溶剂消耗很低，大约是液相仪的十分之一；缩短了每步降解循环时间，因此提高了效率。此仪器最多可测55个残基序列，重复收率达到98。,第六节由已知序列肽段建立蛋白质的一级结构,三、酰胺基位置的确定,四、糖类、脂类和磷酸基位置的确定,二、二硫键位置的确定,一、重叠肽（接头肽）,一、重叠肽（接头肽）,二、二硫键位置的确定,酶水解蛋白质,保留二硫键的完整性,找出含二硫键的肽,拆开二硫键,测定两个肽的序列,与一级结构对比,14C碘乙酰胺封闭。,二硫键只在微酸环境中（pH26.5）稳定。胃蛋白酶是常用的酶。其它酶（如胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、嗜热菌蛋白酶）也要在pH6.5进行反应。酶水解后，只需将含二硫键的肽分离出来进行分析即可。可用特殊的二硫键显色反应检出含二硫键的肽。,三、酰胺基位置的确定,确定酰胺基位置的方法有三种：l、当肽没有暴露于可使酰胺转化为游离酸的条件下时，有可能在Edman序列分析期间用TLC或GC将苯异硫脲（PTH）化的酰胺与游离酸分开；2、含单一Asx或Glx的分离肽走电泳，常可指出其中是酰胺还是游离酸;3、用碳二亚胺甘氨酸甲酯偶联法共价衍生游离羧基，能产生游离羧基的放射性衍生物。,二硫键和酰胺键位置的确定,1、二硫键位置的确定一般采用胃蛋白酶处理没有断开二硫键的多肽链，再利用双向电泳技术分离出各个肽段，用过甲酸处理后，将可能含有二硫键的肽段进行组成及顺序分析，然后同其它方法分析的肽段进行比较，确定二硫键的位置。,2、酰胺基的确定即要确定肽链中的侧链羧基和C端羧基是以-COOH形式存在还是以-CONH2形式存在,也就是要确定是Glu、Asp还是Asn.方法：（1）Edman序列分析；（）电泳（）碳二亚胺甘氨酸甲酯偶联法,四、糖类、脂类和磷酸基位置的确定,这些共价衍生物通常连接在非常独特的氨基酸侧链上：糖类通过Asn氮原子或Ser氧原子连接。通过氧连接时对酸不稳定；脂肪酸通过Ser、Thr或Cys残基，以酯键与蛋白质相连；磷酸基通过Ser，有时通过Tyr、His与蛋白质相连。,第七节蛋白质一级结构研究进展,迄今完成一级结构分析的蛋白质种数已在1200种以上，最长也已超过1000个氨基酸残基，如大肠杆菌半乳糖苷酶由1021个氨基酸残基组成。当前序列研究总的趋向是向快速化，微量化发展，这是生命科学日新月异发展的需要。,第七节蛋白质一级结构研究进展,一、Edman降解试剂和方法上的改进二、序列仪设计上的改进和创新三、质谱法在蛋白质序列分析中的应用四、用测定核酸序列推断蛋白质序列,四、用测定核酸序列推断蛋白质序列,一次实验测定100个核苷酸的序列。含800个核苷酸的片断也可测出序列。测定DNA序列要比测定相应的蛋白质的序列容易得多。因此，测定核苷酸序列已成为测定蛋白质一级结构的新的有力方法。实际测定并不是从DNA样品开始，而是从待测序列的蛋白质样品开始。,如何进行测序呢？,实验动物体内，产生专一性抗体,免疫或分子杂交分离相应蛋白质的mRNA,mRNA反转录成cDNA,克隆扩增分离cDNA,分析测定cDNA序列,寻找与cDNA序列相对应的部分,推测出蛋白质的氨基酸顺序,测知蛋白质的N端和C端的部分序列，依据密码编码规律,由上述过程可以看出，虽然核苷酸序列分析法很有发展前途，但仍离不开适当的氨基酸序列分析，因为单独使用核苷酸序列分析法有许多弱点，主要是：不知道表达蛋白质N端和C端的序列，则不可能正确无误地找到cDNA内的结构基因，也就是说，从cDNA的核苷酸序列导出成熟蛋白质的氨基酸序列的最起码条件是，要测定蛋白质的N端和C端，否则不知道DNA序列的起点和终点，甚至搞不清阅读框架。阅读框架必须由直接的氨基酸序列分析来控制。,(3)即使找到了正确的阅读框架，也有可能读错一个核苷酸，导致结果错误。(4)在重复序列区域，不仅蛋白质水平上的分析有困难，核苷酸序列分析同样有困难。(5)核苷酸序列内的中间序列（内含子）必须直接由蛋白质序列分析来控制。(6)新生多肽链常发生翻译后的修饰作用，这就需要适当的氨基酸序列。单用核苷酸序列分析不能得到成熟蛋白质的结构信息。,蛋白质构象的确定,.X射线结晶（X-RayCrystallography）.冷冻电镜术（CryoelectronMicroscopy）.核磁共振（nuclearmagneticresonance,NMR）,.X射线结晶（X-RayCrystallography）,X射线波长很短（0.0110nm）。用于结构分析的是单色X射线X射线照射绕晶轴旋转的蛋白质结晶，产生许多衍射线。用照相底片等方法记录，便得到了许多衍射图测定衍射图上各个衍射斑点的位置和强度及重原子在重原子衍生物中的位置，用同晶置换法解出蛋白质晶体的衍射相角计算并绘制蛋白质分子的电子密度图，参照蛋白质的一级结构和二硫键信息，解出蛋白质分子的构象,X射线结晶（X-RayCrystallography）,.冷冻电镜术（CryoelectronMicroscopy）,蛋白质样品在液氦中快速冷冻以保存其结构。用冷冻电镜测定蛋白质在冷冻和水合状态下的结构。在胶片上记录图象时，用低剂量电子以防止射线破坏蛋白质结构。软件分析图象并重构蛋白质三维结构。产生的分子模型的质量可以与X射线媲美，而且比X射线分析节省人力和物力。,结合RNA的snRNPs,例一,脊髓灰质炎病毒颗粒（poliovirusparticle）,a：没结合受体，圆形,b、c、d：结合了受体后，有很多突起,例二,.核磁共振（nuclearmagneticresonance,NMR）,限于20Kda以下的蛋白质。将浓缩的蛋白质溶液放入磁场中，测出不同原子的共振频率。每一个原子共振频率都受相邻原子的影响，而且离得越近，影响越大。放大这种效应，就能测出氨基酸残基间的距离，用于产生蛋白质的三维结构模型。也可用于蛋白质结构域分析。,E.coli外膜蛋白A的跨膜结构域,a：NMR产生的结构b：带子模型c：NMR产生的结构与X射线衍射图（蓝色）比较,实例,蛋白质的检测,一、抗体检测法二、WesternBlotting三、放射性同位素标记法,一、抗体检测法,多抗（polyclonalantibodies,通