第七节-核酸的变性、复性与分子杂交(2012)

第二章核酸,第七节核酸的变性、复性与分子杂交,1、核酸的变性,在某些理化因素的作用下，DNA分子中的碱基堆积力和氢键断裂，空间结构被破坏，使双链分离，这种现象称为核酸的变性,1.1定义,1.2引起DNA变性的因素,1.2.1加热（热变性）,DNA变性时，DNA双链发生解离，共轭双键更充分暴露，当DNA溶液温度升高到接近水的沸点时，DNA在260nm处的吸收光值明显增加，这种关系叫做DNA的增色效应（hyperchromiceffect）。DNA的变性从开始到解链完全，是在一个相当窄的温度内完成的，在这一范围内，紫外光吸收值增加达到最大增加值一半时的温度叫做DNA的熔点（meltingpointTm）。,浓度50ug/mL时，双链DNAA260=1.00，完全变性（单链）A260=1.37，游离碱基、核苷酸A260=1.60，当A260增加到最大增大值一半时，即1.185时，对应的温度即为Tm。,1.2.2pH,1.2引起DNA变性的因素,过量酸使A、G、C上的氮原子质子化，不利于氢键形成；过量碱使G、T上的氮原子去质子化，亦不利于氢键形成,1.2.3有机溶剂,尿素和甲酰胺,1.3解链温度or熔解温度（Tm）或称熔点,在实验中，Tm值计算公式：Tm=69.3+0.41(G+C%)小于20bp的寡核苷酸：Tm=4（G+C）+2（A+T）,1.3.1定义,DNA的变性从开始到解链完全，是在一个相当窄的温度内完成的，在这一范围内，紫外光吸收值增加达到最大增加值的50时的温度叫做DNA的熔点（Tm）,1.3.2影响DNA的Tm值的因素,G-C含量与Tm值成正比测定Tm，可推知G-C含量。G-C%=（Tm-69.3）2.44,A,B,图A,BTm值与GC含量的关系,介质中离子强度离子强度高，Tm高。,介质中离子强度离子强度高，Tm高。,介质中离子强度离子强度高，Tm高。,+,+,2核酸的复性2.1定义DNA复性是指当变性DNA的溶液缓慢降温，DNA的互补链又可重新聚合，形成规则的DNA双螺旋的现象。（热变性后的复性又称为退火）,3.核酸的分子杂交,3.1核酸的分子杂交（hydridization）：两个不同来源的互补单链多聚核苷酸之间的碱基配对过程。（P746)探针技术，它是指利用标记分子对其它分子的识别性而实现对后者进行检测的一种技术，我们把标记的分子叫探针（Probe）。DNA探针cDNA探针RNA探针,3.2SouthernBlotting,酶切DNA,分离DNA,转移DNA,杂交DNA,显影,3.3NorthernBlotting研究对象是mRNA，探针一般是DNA。总RNA或mRNA需在变性条件下电泳（乙二醛、甲醛）,Northern杂交是用鉴定(中国科学院2003年攻读硕士学位研究生入学试题生物化学与分子生物学卷),4.核酸的凝胶电泳P742,4.1琼脂糖电泳,用于大片段DNA的分离，精度低，但分离范围广,4.2PAGE（聚丙烯酰胺凝胶）电泳用于小片段DNA的分析，精度非常高,4.3影响核酸凝胶迁移率的因素：核酸分子的大小，迁移率与分子量的对数成反比凝胶浓度DNA的构象，超螺旋最快，线形其次，开环最慢。,小结,1.核酸的变性2.引起DNA变性的因素加热PH有机试剂3.熔点（Tm）4.影响DNA的Tm值的因素G-C含量