第七章--植物基因工程

第七章植物基因工程,转基因植物,世界上第一种基因移植作物是一种含有抗生素药类抗体的烟草，1983年得以培植出来。,转基因番茄1994年，美国研制成功抗干旱、早熟、保鲜的转基因番茄商品化之后，我国也相继成功培育出优良品种的转基因番茄，以满足人们的需求。,转基因甜椒,甜椒在栽培的过程中，容易受病毒的感染。我国科学工作者，采用转基因技术，培育出抗病毒的甜椒。,转基因油菜油菜是人们食用油的主要来源之一。一般油菜籽的含油量约为40左右。通过转基因技术，培育出来的油菜籽，可以大大地提高它的出油率。而且油的纯度质量更好。,玉米是主要粮食之一，又可以提炼油脂，也可以用作食品和工业的原料以及作饲料，浑身是宝。人们称它是含金的植物。如今培育出转基因玉米，品质更好，产量更高。,转基因玉米,转基因牵牛花,我国科学工作者，用转基因技术，可以转变矮牵牛花的花色，使矮牵牛花的花色更加丰富多彩。,转基因小麦从植物体中分离出合成赖氨酸的基因，把这基因转入小麦植株中，培育出转基因小麦。用这种转基因小麦制造出来的面粉，更适合用来烤面包，而且面粉中赖氨酸含量高，这种面包的营养价值高。,本章主要内容：第一节植物基因工程的发展现状第二节植物基因工程方法第三节转化子细胞的筛选第四节转化体的鉴定与证明第五节植物基因工程研究的应用和展望,植物基因工程的概念,植物基因工程是以植物为受体的一种基因操作，即以分子生物学为理论基础，采用基因克隆、遗传转化（根癌农杆菌Ti质粒介导法、基因枪法、原生质体介导法等），以及细胞、组织培养技术将外源基因转移并整合到受体植物的基因组中，并使其在后代植株中得以正确表达和稳定遗传，从而使受体获得新性状的技术体系。,第一节植物基因工程的发展现状,转基因植物的应用前景和理论意义,通过将目的基因导入农作物或园艺作物中，改变它们的遗传特性，使植物免受病虫的危害、获得抗除草剂的特性、改变种子中淀粉、蛋白质的含量和组成、改变花的形状和颜色、改变植物的育性和不亲合性以及改变植物的抗逆性等。转基因植物可作为一种生物反应器，生产药用蛋白和植物次生代谢产物或者生产某些有机化合物。转基因植物为人们研究某一基因功能及其再生长发育中的作用提供了强有力的工具。,国际转基因作物发展现状,从1996年到2004年间，全球转基因植物的生产和利用超出了当初预料，基因作物种植面积增长了近48倍，从1996年的170万公顷增加到2004年的8100万公顷。,国内转基因作物发展现状,在某些领域达到了国际先进水平。2004年全国转基因作物种植面积为370万公顷，成为继美国、阿根廷、加拿大、巴西之后的转基因植物种植第五大国。,第二节植物基因工程方法,原生质体介导法基因枪法根癌农杆菌介导法,一、原生质体介导法,概念：以原生质体为受体，借助于特定的化学或物理手段将外源直接导入植物细胞的方法。主要方法:,PEG介导的基因转化脂质体（liposome)介导的基因转化电激法激光导入法显微注射法,PEG介导的基因转化,原理：利用化学试剂，如聚乙二醇（PEG）聚烯醇(细胞促融剂)等，诱导原生质体摄取外源DNA分子，进入原生质体的外源DNA分子就有可能通过某种机制整合到基因组中，完成遗传转化过程。如：转基因烟草,脂质体介导基因转化,原理：利用脂类化学物质包裹外源DNA成球体,通过植物原生质体的吞噬或融合作用把包含外源DNA的脂质体转入受体细胞。特点：转化率高;操作繁琐;技术性高。,电激法介导基因转化,原理：利用高压电脉冲作用，在原生质体膜上“电激穿孔“，形成可逆的瞬间通道,从而促进外源DNA进入原生质体。特点：转化率高；操作简便；容易造成原生质体损伤。,显微注射介导的基因转化,原理：利用显微注射仪将外源DNA直接注入受体的细胞质或细胞核，从而实现外源基因的转移。优点：方法简单、转化率高；纯物理方法，适用于各种植物和材料，无局限性；对受体细胞无毒害，有利于转化细胞生长发育；培养过程无需特殊选择系统。,激光微束介导的基因转化,原理：将激光引入光学显微镜聚焦成微米级的微束照射培养细胞，在细胞膜上形成能自我愈合的小孔，使加入细胞培养基里的外源DNA流入细胞，实现基因的转移。优点：操作简便；工作效率高；无宿主限制，适应于各种动植物；对受体细胞生命活动影响小；受体的类型广泛；用于细胞器的基因转化,二、基因枪法（微弹轰击法）,工作原理：将外源DNA包被在微小的金粒或钨粒表面，然后在高压的作用下将微粒高速射入受体细胞或组织，微粒上的外源DNA进入细胞后，整合到植物染色体上并得到表达，从而实现外源基因的转化。动力类型：火药爆炸力；高压气体；高压放电,操作步骤,（1）制备DNA微弹；（2）准备靶外植体材料；（3）DNA微弹轰击；（4）培养轰击后的外植体,转化率影响因素,金属微粒金粉颗粒较钨粒性质优良,但是价格昂贵.DNA沉淀辅助剂这些化合物对DNA在微粒上的黏附有重要作用,但对植物受体细胞也产生一定的伤害.DNA纯度及浓度微弹速度植物材料内在因素,三、根癌杆菌介导法,根癌农杆菌广泛亲染双子叶植物和裸子植物。根据根癌农杆菌诱导植物形成的根瘤中冠瘿碱的不同可将根癌农杆菌分为章鱼碱型、胭脂碱型和农杆碱型3种类型。在根癌农杆菌内有一个大的致瘤质粒，简称Ti质粒。,Ti质粒的改造策略Ti质粒是植物基因工程的一种天然载体，但野生型Ti质粒直接作为植物基因工程载体存在着学多障碍：（1）质粒过大，操作困难（2）大型的Ti质粒有多个酶切位点（3）植物激素类的影响（4）Ti质粒中存在不起作用的序列（5）Ti质粒的局限性,为了使Ti质粒变成操作简便、转化有效的外源基因转移载体,必须对野生型的Ti质粒进行改造.植物转基因有一元载体系统和二元载体系统,所以采取不同的改造策略.二元载体较一元载体的优点:构建比较方便;二元载体不会带入大量的无用的多余的DNA序列.因为一元载体的T-DNA区中含中间载体,他们会随同外源基因一起被转入植物细胞中.,根癌农杆菌Ti质粒介导的基因转化的分子机理六个步骤：（1）农杆菌对受体（2）农杆菌附着到植物受体细胞（3）诱导启动毒性区基因表达（4）类似接合孔复合体的合成和装配（5）T-DNA的加工和转运（6）T-DNA的整合,基因枪法与根癌农杆菌介导法的比较,基因枪法多拷贝整合概率高，外源基因易沉默表达。农杆菌介导低拷贝整合（多为单拷贝整合）转化效率较高。基因枪法纯物理转化，不存在物种的限制。农杆菌介导存在宿主范围的局限性。基因枪法适于以细胞器为转化目标的转基因研究。,第三节转化子细胞的筛选,当采用某种转基因方法处理外植体后，通常外植体中仅仅只有几个少数细胞获得转化，只有采取有效的筛选方法，才能高效准确的筛选到转化细胞。一般情况下，转化载体上除了带有目的基因外，大多还携带选择基因，以供转化细胞筛选使用。,转化筛选细胞的方法主要有两种：一、根据选择基因的特点在筛选选择培养基中加入能抑制非转化细胞生长的有毒物质（如抗生素、除草剂等），选择基因通常为一种解毒基因，可以解除培养基中有害物质对细胞生长的抑制作用，这样只有转化细胞才能生长繁殖；二、受体细胞为营养缺陷型细胞，在选择性培养基中不能生殖，而选择培养基可以补偿这种缺陷，使转化细胞在选择性培养基上正常生长。,一、植物基因工程中的选择基因,植物基因工程中的基因主要是一类编码可使抗生素或除草剂失活的蛋白酶基因。最常用的有新霉素抗性基因（neor）、庆大霉素抗性基因（gentr）、潮霉素磷酸转移酶（HTP）基因（hpt）,以及膦丝菌素乙酰转移酶基因（bar）等。,1、新霉素抗性基因（neor）新霉素抗性基因是从大肠杆菌转座子Tn5中分离的，其对应失活的选择试剂为卡那霉素、新霉素和G418。卡那霉素、新霉素可通过与核糖体小亚基结合抑制蛋白质的合成，G418可通过抑制80S核糖体的功能而阻断真核细胞中的蛋白质合成。新霉素抗性基因可使选择试剂磷酸化而失效。,2.庆大霉素抗性基因（gentr）,该基因编码一种乙酰转移酶，属抗生素标记基因，它通过对庆大霉素的乙酰化而使其失活。该选择系统目前也有一定的应用，例如矮牛、烟草和番茄。,3.潮霉素磷酸转移酶（HTP）基因（hpt）潮霉素是一种很强的细胞抑制剂，对许多植物都有很强的毒性。潮霉素磷酸转移酶可通过对潮霉素磷酸化而使其失活。4.膦丝菌素乙酰转移酶基因（bar）该基因是从吸水链霉菌中克隆的一种基因，其对应的选择试剂为膦丝菌素（basta）,膦丝菌素可抑制谷氨酰胺合成酶的活性，从而导致非转化细胞发生氨的致死性累积。,二、报告基因,报告基因是指其编码产物能够被快速测定、常用于判断外源基因是够成功地导入体细胞，是否启动表达的一类特殊用途的基因。它应用不依赖于外界选择压力的存在，这一点也是它与选择基因的区别之处。将报道基因与表达载体的启动子序列相连，并转染到细胞内，然后检测细胞内报道蛋白的含量或活性，即报道基因技术。可在基因表达的时空调控、受体特性、药物筛选和基因导入系统等研究中可广泛应用。,理想报告基因的基本要求：1、受体细胞不存在相应的内源等位基因的活性。2、它的产物是唯一的，且不会损害受体细胞。3、具有快速、廉价、灵敏、定量和可重复性的检测特性。目前最常用的报告基因有：-葡萄糖苷酸酶基因（gus）;氯霉素乙酰转移酶基因；荧光素酶基因;分泌型碱性磷酸酶;荧光蛋白家族,-葡萄糖苷酸酶基因（gus）,gus基因编码-葡萄糖苷酸酶,存在于某些细菌体内，该酶是一种水解酶，能催化许多-葡萄糖苷酸类物质的水解。绝大多数的植物细胞内不存在内源的GUS活性，许多细菌及真菌也缺乏内源GUS活性，因而gus基因被广泛应用作转基因植物、细菌和真菌的报告基因，尤其是在研究外源基因瞬时表达的转化实验中，gus基因应用最多。其最大优势是易于用组化法观测其原位表达，是最常用的监测转染效率的报道基因之一。,氯霉素乙酰转移酶基因,该基因来自大肠杆菌转座子Tn9，它能够催化乙酰基团从乙酰辅酶A转移到氯霉素分子上，导致氯霉素分子发生乙酰化作用，从而使其失去活性。真核细胞中部含有氯霉素乙酰转移酶基因，无该酶的内源活性，因而该基因可作为真核细胞转化的选择基因及报告基因。,CAT在哺乳细胞无内源性表达，性质稳定，半衰期相对较短，适于检测其瞬时表达。可用同位素标记法、荧光法和自动ELISA法检测其活性，也可进行Westernblots和免疫组织化学分析。CAT与其它报道基因相比，线性范围较窄，灵敏性较低。,荧光素酶,荧光素酶是能够催化不同底物(荧光素、COelenterazine)氧化发光的一类酶，哺乳细胞无内源性荧光素酶。最常用的荧光素酶有细菌荧光素酶、萤火虫荧光素酶和ReniHa荧光素酶（海洋腔肠Luc）。细菌荧光素酶对热敏感，因此其在哺乳细胞的应用受到限制。萤火虫荧光素酶灵敏度高，检测线性范围宽达7-8个数量级，是最常用于哺乳细胞的报道基因。用荧光比色计即可检测酶活性，因而适于高通量筛选。随着具有膜通透性和光裂解作用的萤火虫荧光素酶的应用，无需裂解细胞即可检测酶活性；ReniHa荧光素酶催化COelenterazine氧化，产物可透过生物膜，可能是最适用于活细胞的报道分子。,荧光素酶基因,该基因有很多种，它可以催化荧光素发出荧光。荧光素是荧光素酶催化的底物合成，不同荧光素的化学结构有一定差异甚至完全不同。荧光素酶基因的活性检测非常简单，直接将被检的材料进入加有荧光素和ATP的缓冲液中，置于暗室用肉眼直接观察荧光，或覆盖X-光胶片曝光，也也用荧光光度计定量检测.,荧光蛋白家族,荧光蛋白家族是从水螅纲和珊瑚类动物中发现的分子量为2030kD的同源性蛋白。绿色荧光蛋白(GFP)是应用最多的发光蛋白。GFP存在于发光水母(AequoreaVictoria)。用395nm的UV和475nm的蓝光激发，GFP可在508nm处自行发射绿色荧光，无需辅助因子和底物。GFP最大的优势是无需损伤细胞即可研究细胞内事件。1991年克隆了GFP基因，目前已获得几个突变体。如“红色迁移”突变体(“redshift”mutant)，其荧光更强。其突变体还有蓝色荧光蛋白(BFP)、增强型GFP(enhancedGFP)和去稳定EGFP(destabilizedEGFP)等。红色荧光蛋白(RFP)是从珊瑚(Dcosomasp)中分离的发光蛋白(drFP583或DsRed)可发射明亮的红色荧光。,这些常用的报道基因也可被联合应用，可同时检测2个甚至3个基因的表达。报道基因的选择依赖于其灵敏性、可靠性及监测的动力学范围。稳定性好的报道基因适于基因转录动力学研究和高通量筛选，尤其适用于基因转移的定性研究。,报道基因,随着技术和检测方法的进步，荧光分析以其能够将细胞内报告基因的活性可视化和对细胞的非破坏性而越来越成为主流，因此荧光素酶和绿色荧光蛋白这两种可发出荧光的报告基因成为众多报告基因中的后起之秀.,绿色荧光蛋白(GFP),1992年，Prasher和Chaltqe报道了几种生物发光水母的发光是由于能量转移至GFP所致，该蛋白在接受了Ca2+激活的光蛋白水母素的能量后可在体内产生荧光，这一过程不需要底物或辅助因子。GFP是一条由238个氨基酸组成的多肽链，纯化的GFP与体内表达的该蛋白有相似的发光谱，无论在原核或真核细胞中表达，当用蓝光或紫外光激发下，都能产生一种很亮的绿色荧光。鉴于上述特性以及所具有的低毒性、不干扰正常的细胞活动等优点，从此开辟了GFP在生物领域中(尤其是体内分析)的广泛应用，目前已应用于启动子分析、转基因领域、基因表达的蛋白质定位、细胞定位以及药物的筛选等诸多方面。,为了验证外源基因整合到染色体.我们采用PCR技术.Southern杂交技术.为了验证外源基因是否表达.我们采用RT-PCR技术、Northern杂交技术、Western杂交技术.,第四节转化体的鉴定和证实,PCR检验外源基因的整和,在转基因个体的检测中,通过设计外源基因两端的特异引物,采用PCR可以使外源基因得到大量扩增,然后通过琼脂糖凝胶电泳检测特意扩增带的有无,从而判断外源基因是否整合到受体植物的基因组.优点:由于对模板DNA的要求少,适合与转基因体的早期检测.缺点:容易受到外界因素的干扰.,Southern杂交检测外源基因的整合,原理:来源不同但具有互补序列的两条多核苷酸链通过碱基配对原则形成稳定的结构.其中一条被标记成为探针,探针与互补的核苷酸序列杂交,通过放射自显影技术可以被检测出来.杂交方式:Southern斑点杂交Southern印记杂交(最常用)Southern原位杂交,RT-PCR杂交检测外源基因的整合,适用范围:外源基因在受体细胞是否转录的初步检测.原理:以转基因个体总RNA或mRNA为模板进行反转录,然后PCR扩增,如果可以获得特意的cRNA扩增条带,则表明外源基因实现了转录.优点:简单快速对mRNA抽提的数量和质量都要求不高.,Northern杂交检测外源基因的表达,与Sout