第九章-人工合成酵母基因组(二)

Buildingblock合成与组装,李炳志2014-4,TPCR,FPCR,Cloning,CSPCR,Sequencing,Buildingblocks合成,引物混合（Oligomixes）,TPM（templatelessprimermix）终浓度：300nMOPM（outerprimermix）终浓度：3M,PCR反应组分,模板：DNA引物：正向引物与反向引物dNTPs（脱氧核糖核苷酸混合物）耐热DNA聚合酶：Taq、pfu、Phusion等缓冲液（Mg2+）,PCR反应体系,PCR反应程序,无模板PCR（TemplatelessPCR,TPCR）,TPCR模板4,+,无模板PCR（TemplatelessPCR,TPCR）,文献中大多称为PCA（polymerasecyclingassembly）引物等浓度存在，是引物的组装过程，不是扩增过程产物包含多种大小的基因片段，其中包含全长片段,完成PCR（FinishPCR,FPCR）,FPCR模板：TPCR产物1:10稀释引物：FPCR引物酶：高保真酶程序：94,3min25cycles:94,30s；55,30s；72,15s72,3min;4,+,完成PCR（FinishPCR,FPCR）,FPCR产物的琼脂糖凝胶电泳检测,FPCR产物与载体的连接,根据琼脂糖凝胶电泳检测结果调整FPCR产物加入量（0.54l）平末端连接（载体与片段摩尔比=1:31:8）,连接体系的大肠杆菌转化,蓝白斑筛选,抗性和蓝白斑筛选（IPTG+X-gal）37过夜培养（倒置）,菌落PCR筛选（ColonyscreeningPCR）,测序验证,设计软件,(),设计软件,设计软件,GACCACGGAGCTCGGCGACTACGGAGCGCGGTTCTTGGATCTCTTCTTGTCACGATCGAGCCGCTGATGCCTCGCGGGTACGAACCATCTTAGTTGCCAAGAACCTAGAGAAGAA,GACCACGGAGCTCGGCGACTACGGAGCCGGTTCTTGGATCTCTTCTTGTCACGATCGAGCCGCTGATGCCTCGCGGGTACGAACCATCTTAGTTGCCAAGAACCTAGAGAAGAACAGTG,1)将750bp的BB拆分成长约60bp的寡核苷酸链，包含20bp的重叠区，20bp的缺口,2)增加或减少重叠区长度以匹配退火温度,20bp重叠区Tm=59太高减少重叠区,20bp重叠区Tm=48太低增加重叠区,19bp重叠区Tm=56,25bp重叠区Tm=56,寡核苷酸链设计与退火温度优化,设计软件,Dpndigestion,addprimers,transformation,=mutation,cycleextensionPCR,突变修复环状延伸PCR,Dpn识别甲基化位点GATC,PCR,OE-PCR,突变修复重叠延伸PCR（OE-PCR）,搭桥PCR的原理示意图,基因片段的组装OE-PCR,DNAassemblyinyeast,基因片段的组装酵母组装,基因片段的组装Gibson等温组装,总