第六章--基因克隆的载体与受体_

质粒载体,噬菌体载体,大分子DNA克隆载体,第六章基因克隆的载体与受体,用于基因转移的受体菌或细胞,载体载体是将“目的”基因即重组DNA分子导入受体细胞的运载工具。DNA载体：质粒、噬菌体、病毒、细菌或酵母菌人工染色体等，现在使用的载体都是采用基因工程的方法构建的。载体的条件：.具有复制原点，能自我复制，并能带动携带的外源DNA一起复制。.具多克隆位点，即有多种限制酶的切点；且切点不存在于复制原点或抗性选择标记内，即切点不影响复制和标记性状的表现。.至少有一个选择标记基因，便于鉴定进入宿主细胞与否，如抗生素基因或某种酶的基因，而宿主细胞没有这些基因。.易从宿主细胞中回收克隆。,第一节质粒载体,一、质粒（plasmid）,是独立于染色体以外的能自主复制的双链闭合环状DNA分子。,存在于细菌、蓝藻、霉菌、酵母等细胞中。,（1）分子小：,1.质粒的一般生物学特性,1200kb,（2）编码基因少：,23个中等大小的蛋白质。,（3）形状：,双链环状DNA。,（酵母的“杀伤质粒”是RNA）。,如抗菌素抗性、代谢特征等，赋予细菌一些额外的特性（非必须）。,（4）质粒的空间构型：,共价闭合环状DNA（cccDNA),呈超螺旋（SC）（supercoil）,CovalentclosecircularDNA,线形DNA（linear，lDNA）,一条链上有一至数个缺口。,开环DNA（opencircular，ocDNA）,（5）质粒空间构型与电泳速率,同一质粒尽管分子量相同，不同的构型电泳迁移率不同：,scDNA最快、lDNA次之、ocDNA最慢。,SC,OC,L,二、质粒的类型,在大肠杆菌中的质粒，可以分为：,接合型质粒:,非接合型质粒,能自我转移,不能自我转移,除了带有自我复制所必需的遗传信息外还带有一套控制细菌配对和质粒接合转移的基因。,如：F质粒（性质粒、或F因子）：,甚至能使寄主染色体上的基因随其一道转移到原先不存在该质粒的受体菌中。,又叫自我转移型质粒。,1.接合型质粒：,不符合基因工程的安全要求。,2.非接合型质粒：,虽然带有自我复制所必需的遗传信息，但失去了控制细菌配对和质粒接合转移的基因，因此不能从一个细胞转移到另一个细胞。,（1）R质粒（抗性质粒）：,带有一种或数种抗生素抗性基因，使寄主获得同样的抗生素抗性性状（resistance）。,符合基因工程的安全要求。,三、质粒的复制类型,1.严紧型质粒（stringentplasmid）,拷贝数少，只有13份拷贝。,2.松弛型质粒（relaxedplasmid）,拷贝数多，有1060份拷贝。,（接合型质粒分子量大，一般属严紧型）。,（非接合型质粒分子量小，一般属松弛型）。,氨苄青霉素抗性（Ampr）卡那霉素抗性（Kanr）四环素抗性（Tetr）链霉素抗性（Strr）氯霉素抗性（Cmlr）,3.质粒的选择标记及其工作原理：,（1）选择标记,抗菌素抗性,绝大多数质粒载体都是用抗菌素抗性标记：,遗传标记,使受体菌发生遗传性状的改变的基因。,经典的大肠杆菌质粒载体,1.pSC101,第一个成功地用于克隆实验的大肠杆菌质粒载体。,（1）类型,天然质粒，属低拷贝型。,（2）长度,9.09kb,（3）选择标记,四环素抗性Tetr,6个克隆位点：EcoRI、XhoI、PvuI、HindIII、BamHI、SalI主要使用EcoRI。,（其中HindIII、BamHI、SalI3个位于选择标记Tetr的内部）,（4）克隆位点,当带有抗菌素抗性基因的载体进入受体菌后，受体菌才能生长。,含有抗菌素的培养基（选择培养基）中能够生长抗菌素抗性基因的受体菌,抗菌素选择原理,活,死,抗性基因,抗菌素,另：pUC18质粒具有以下特点：.分子量小，可接受较大外源片段；.拷贝数多，500个细胞；.克隆位点的酶切位点多，克隆方便；.具有用于检测重组质粒的选择标记（如互补的显色表型）。,lacZ的肽互补,1）-肽（lacZ）：,-半乳糖苷酶N端的一段氨基酸片断（11-41氨基酸）。,lacZ只有在4聚体的状态下才有功能此酶由500kd的四聚体构成,C端大部分,N端的11-41aa,C端大部分,N端的11-41aa,C端大部分,N端的11-41aa,C端大部分,N端的11-41aa,4聚体,2）受体菌lacZ突变（lacZM15）,受体菌基因组的-半乳糖苷酶基因的氨基端有缺失（缺失肽），不能形成4聚体的活性酶，不能分解X-gal,受体菌株：JM系列、TG1、TG2、XL1-blue、XS127、XS101、KK2186、MV1184、DH5a,pUC质粒载体上的lacZ编码肽与这个缺失突变的-半乳糖苷酶“互补”，使它能形成4聚体，从而能分解X-gal，产生蓝色物质。,C端大部分,N端的11-41aa,pUClacZ,受体菌lacZ,3）载体lacZ与互补,4）互补的插入失活,pUC载体上LacZ的5端有一段多克隆位点(MCS)区，本身虽不干扰LacZ的合成，但插入外源基因就会阻止LacZ的合成。不能互补。,lacZ,5,3,肽移码突变,lacZ,5,3,肽,不互补,互补,MCS,外源DNA,IPTG的诱导作用,IPTG是乳糖的类似物。能诱导lac操纵子的启动转录，使受体菌基因组中的lacZ的C端部分和载体的lacZ肽都表达。从而互补。,但载体MCS上插入外源DNA后，仍然不能产生肽！,IPTG,通过看培养皿上的菌斑的颜色就能直接知道是否有DNA插入。,MCS无插入时，互补，蓝菌斑。MCS有插入时，不互补，白菌斑。,IPTG诱导的结果：,第二节噬菌体载体,噬菌体是一类细菌病毒（Bacteriophage）。,一、噬菌体的一般特性,结构：蛋白质外壳内包裹着DNA（双链、单链、线性、环状等）。,双链噬菌体为类噬菌体，单链丝状噬菌体有M13、f1、fd噬菌体。重组DNA技术中常用的噬菌体克隆载体主要有类噬菌体和M13噬菌体。类噬菌体:一种是插入型载体，只具有一个可供外源DNA插入的克隆位点，另一种是替换型载体，具有成对的克隆位点，在这两个位点之间的DNA区段可以被外源插入的DNA片段所取代。在基因克隆中二者的用途不尽相同。插入型载体只能承受较小分子量（一般在10kb以内）的外源DNA片段的插入，广泛应用于cDNA及小片段DNA的克隆。而替换型载体则可承受较大分子量的外源DNA片段的插入，所以适用于克隆高等真核生物的染色体DNA。,二、噬菌体载体的类型,M13噬菌体载体M13噬菌体是基因组为一长度6.4kb的且彼此同源性很高的单链闭环DNA分子。该类噬菌体作为克隆载体，主要用于克隆单链DNA。,第三节大分子DNA克隆载体,酵母人工染色体的基因组十分庞大，约含4109bp，建立和筛选人的基因组文库，要求有容量更大的载体，酵母人工染色体（yeastartificialchromosome,YAC）载体应运而生。YAC含有酵母染色体端粒（telesome）、着丝点(centromere)及复制起点等功能序列，可插入长度达200-500kb的外源DNA，导入酵母细胞可以随细胞分裂周期复制繁殖。,YAC：,细菌人造染色体（BacterialArtificialChromosomesBAC）通常是在大肠杆菌性因子F质粒的基础上构建的，命名为pBACs，其装载量范围在50-300kb之间。pBACs主要适用于：克隆大型基因簇（genecluster）构建动植物基因文库,BAC：,大肠杆菌,遗传背景清楚，载体受体系统完备，生长迅速，培养简单，重组子稳定,适用于外源DNA的扩增和克隆、原核生物基因的高效表达、基因文库的构建，是DNA重组实验和基因工程的主要受体菌,第四节用于基因转移的受体菌或细胞,枯草杆菌,遗传背景清楚，蛋白质分泌机制健全，生长迅速，培养简单。,适用于原核生物基因的克隆、表达以及重组蛋白多肽的有效分泌,链霉菌,抗生素的主要生产者，分子遗传相对操作简便,主要用于抗生素生产菌株的改良,遗传不稳定，生长相对缓慢,酵母菌,具有真核生物的特征，遗传背景清楚，生长迅速，培养简单，外源基因表达系统完