结构生物学(生物大分子解析方法)

在结构生物学的研究方法和技术中，为了使生物大分子发挥作用，必须满足两个条件：第一，所有希望发挥其功能和活性的生物大分子必须具有特定的、独特的和相对稳定的三级结构；第二，结构性运动。任何破坏都不会导致稳定的第三系结构和结构运动。生物大分子很难发挥其生物功能或活性。一、结构生物学的概念和主要研究方法，结构生物学是通过确定生物大分子的三级结构，来研究生物大分子的结构和功能，从而探索生物大分子的作用机制和原理为研究目的。主要研究方法有：X射线结晶学(X射线蛋白质结晶学)、多维核磁共振(核磁共振)、电子显微镜结晶学和电子显微镜三维重组。随着结构生物学的发展，当时卡文迪什实验室的佩鲁茨肯德勒通过x光结晶学获得了球蛋白的结构。由于X射线晶体学的应用，它使我们能够在晶体水平上研究大分子的结构，并在分子原子的基础上解释大分子。由于他们的开创性工作，华盛顿和克里克获得了1962年诺贝尔生理学和医学奖，佩鲁茨和肯德勒获得了同年的化学奖。从那时起，技术的发展已经成为结构生物学发展的最重要的决定因素。起源：20世纪50年代，华盛顿，克里克发现了DNA的双螺旋结构，并建立了DNA的双螺旋模型。在20世纪60年代和70年代，他们在同一个实验室开发了电子晶体学技术。当时，研究对象主要是有序和高度对称的生物系统，如二维晶体和高度对称的三维晶体。从20世纪70年代到80年代，多维核磁共振光谱学的发明使得研究水溶液中的生物大分子成为可能，这更接近生理状态。从20世纪80年代到本世纪初，冷冻电子显微镜的发明不仅使我们能够研究处于晶体状态和溶液状态的生物大分子的结构，而且还能研究复杂大分子系统的超分子系统。这些是细胞器和细胞。可见，结构生物学的发展过程经历了从结晶到溶解到大分子系统、超分子系统，如核糖体、病毒、溶酶体、线粒体等。X射线晶体衍射法。1912年，布拉格和布拉格父子提出并发展了X射线单晶衍射技术。这项技术首先用于无机晶体分析，然后到了1953年，沃森和克里克被用于DNA晶体分析，直到20世纪60年代，陈德鲁和佩鲁兹被用于研究血红蛋白和肌红蛋白，并逐渐成为研究生物大分子晶体结构的一种重要方法，至今仍占主导地位。它的优点是高分辨率和原子分辨率。它不仅可以用来研究水溶性蛋白质，还可以用来研究膜蛋白和大分子的组装和复合物。它可以给出生物大分子的分子结构和构型，确定活性中心的位置和结构，从分子水平了解蛋白质如何识别和结合客体分子，如何催化，如何折叠和进化等生命的基本过程，并进一步阐明生命现象。例如，在1997年底，使用了X射线单晶衍射方法来完成核小体精细空间结构的测定，其核心粒子分辨率为0128纳米。每个核小体的盘状核包含由8个组蛋白和由146个碱基对组成的DNA形成的八面体。这项杰出的成就对于理解基因转录、DNA复制和修复的动态过程非常重要。此外，应用X射线单晶衍射技术确定蛋白质和核酸的晶体结构，结合分子模拟技术，为新药的设计提供了一个全新的方向，大大缩短了新药的开发过程。新药的设计和开发需要准确理解这些药物靶标的结构和性能。目前所知甚少，现有的绝大多数临床药物都是通过试验筛选获得的。开发一种新药通常需要十多年甚至几十年的时间。通过对人体免疫缺陷病毒蛋白酶的精细结构测定和酶抑制剂作为艾滋病治疗靶点的设计，取得了巨大的成功，艾滋病死亡人数显著减少。生物大分子结构的x光测量原理，为什么要用x光，只有当光源的波长等于障碍物的尺度或光源的波长小于障碍物的尺度时，才能检测到障碍物的信息。X射线的波长相当于原子和化学键的尺度，两者都在数量级上。因此，它可以用来检测蛋白质分子的内部结构。为什么要用衍射来代替x光光源和x光透镜？到目前为止，还没有发现折射x射线的方法。因此，蛋白质分子的内部结构只能通过衍射来研究，这是一种不太直观的方法。什么是水晶？晶体在宏观上有规则的几何形状。它以二维方式排列，以三维方式堆叠。晶体是一种具有长程三维分子有序的固体。针孔光栅，衍射图样，如何根据衍射结果分析蛋白质结构，上述公式也可以表示为：r为电子密度，xyz为实空间坐标v为单位细胞体积| F(hkl)| 2=1(hkl)，I为衍射点的强度，hkl为衍射点坐标a为初始相角，F(X)=ACOS(2pxa)，对于一束X射线F(X)=ACOS(2pxa)，无论其初始相角如何，在接收屏上形成的曝光点是相同的。相反，我们不能仅根据接收屏幕上的曝光点来知道导致曝光点的x光的初始相位角信息。初始相角不能直接测量，但它也是求解电子密度的必要信息。这是用X射线晶体衍射法分析材料结构时需要解决的核心问题相位(相角)。解决相位问题的方法：同构替换法中最原始的方法包括多对同构替换法和单对同构替换法。重原子需要被引入到蛋白质晶体中，并且具有重原子的晶体和没有重原子的晶体的晶体形式需要基本相同。分析过程需要多组没有重原子、重原子甚至不同重原子的多种晶体的衍射数据。异常散射方法包括多波长异常散射方法和单波长异常散射方法。通常需要引入具有强反常散射能力的原子，如硒原子。在没有多个晶体的情况下，通常需要同一晶体在不同波长的X射线照射下的多组衍射数据。随着技术的进步，蛋白质本身的硫原子也开始被用作异常散射源。该分子置换方法需要高度同源的蛋白质分子结构模型，不需要多种晶体，不需要多组衍射数据，方便快捷，但不能用于分析全新的结构。主要技术流程图蛋白质结晶的必要条件均质(纯化)、均质蛋白质分子、非均质(不纯)蛋白质分子、沉淀剂的影响获得蛋白质晶体的方法由于蛋白质分子的尺寸大、表面条件复杂、极性不明显、分子间作用力弱等原因，蛋白质分子有蛋白质结晶技术：分批结晶法、液-液扩散法、透析法、气相扩散法、悬滴法、座滴法、悬滴法和座滴法。当达到蒸汽平衡时，蛋白质所在液滴中晶体溶液成分的浓度将接近于池液的浓度。结晶溶液的组成：沉淀剂通常是不同分子量的聚乙二醇或高浓度的硫酸铵和氯化钠。辅助分子通常是低浓度的盐类缓冲液，例如：汉普顿研究公司的晶体筛# 140.2 McAcl 20.1 MHEPEPSPH 7.528%(体积/体积)的聚乙二醇400。从初始筛选中获得的结晶条件通常不是蛋白质的最佳结晶条件。此时，蛋白质晶体通常具有较差的衍射能力，甚至没有衍射。因此，通常需要优化蛋白质的结晶条件。优化方法是在结晶溶液中沉淀剂和辅助分子的浓度与结晶过程中蛋白质的初始浓度之间建立梯度。相应地，结晶溶液中的酸碱度也应在初始值附近形成梯度。我们将这些梯度排列组合起来，以找出最佳的结晶条件。优化前，优化后，衍射例子，缺点：样品必须是晶体(单晶)，但结晶生物大分子是困难的，特别是结晶分子组装如膜蛋白和病毒。其次，对于像病毒一样大的分子集合体，测量它们的精细结构是非常复杂的。原因如下：233601:大细胞含有非常多的原子，X射线衍射点非常多，而且通常不可能区分、识别和检测它们。第二个是由大单元产生的衍射光斑强度太弱，无法与背景区分开，特别是在高分辨率时。核磁共振也是测量生物大分子结构的重要手段。基本原理是核磁共振。1946年，哈佛大学的珀塞尔和斯坦福大学的布洛赫领导的两个小组在各自的实验室用不同的方法进行了观察。贝尔塞尔使用吸收法，而布洛赫使用诱导法。利用物理原理，通过测量核磁共振谱的特征参数来分析物质的分子结构和性质。核磁共振不会破坏被测样品的内部结构，是一种无损检测方法。因为不同的原子核吸收不同的电磁波，所以可以通过测量和分析被测物质对电磁波的吸收来确定它包含哪种原子以及原子之间的距离，并且可以相应地分析它的三维结构。以蛋白质为例，其二级结构，如螺旋、折叠、转角、环和卷曲，反映了蛋白质分子主链原子在三维空间中的不同排列规律。不同二级结构域之间的核间距、核之间的相互作用和多肽片段的动态特征。所有这些都直接反映了蛋白质三维结构的特征。这些核间距、肽键二面角以及具有不同结构特征的肽键的动力学特征具有特征性的核磁共振谱。因此，我们可以通过分析核磁共振谱来获得蛋白质的三维结构。1H、13C和15N是核磁共振检测的主要目标，每个目标具有不同的共振频率，因此形成了核磁共振氢谱、碳谱和氮谱的三个部分。核磁共振显示，水溶液中大约一半的蛋白质链呈现规则和紧密的三维结构，而另一半则非常松散。目前，科学家已经用这种方法绘制了15% 20%已知蛋白质的结构图。最初，核磁共振技术主要用于核物理研究。用于测量各种原子核的磁矩，误差仅为0.003% 0.005%。到目前为止，它已广泛应用于化学、食品、医学、生物学、遗传学等学科领域，并已成为开展这些领域研究工作的有力工具，甚至是某些领域常规分析中不可或缺的手段(如： che1997年，威特里希用核磁共振方法确定了一种蛋白质-蛋白质感染性蛋白质的结构。核磁共振法的最大特点是，可以直接测量在溶液中处于自然状态的大分子的三维空间结构，其分辨率接近012纳米，但由于大分子量的生物分子核磁共振谱非常复杂，难以解释，所以它只能测量小分子量(15-25kDa)的生物分子，到目前为止只能测定35kDa的生物分子；其次，在测定中要求样品纯度高且数量相对较大，这使得样品制备困难。此外，核磁共振只能用于水性生物样品，不能用于确定膜蛋白或病毒的组装和复合物。另一种方法叫做冷冻电子显微镜计算机三维重建法或单粒子技术(Cryo-EM)。特点是：快速冷冻(103-104Ps)样品悬浮液，样品包埋在无定形无定形的无定形冰膜中，既不会损伤样品，又能保持样品处于自然状态，因此样品制备简单。缺点：分辨率稍低。正在研究的病毒样本的当前分辨率接近0.17纳米，预计在未来几年将达到0.14纳米。核糖体可达1.10纳米，离子通道可达2.10纳米。由于利用冷冻电子显微镜和计算机重建技术研究病毒三维结构所需的样品制备简单，对病毒的大小没有限制，使其发展迅速。到目前为止，已有100多种病毒的三维结构通过冷冻电子显微镜的计算机重建方法得以阐明，远远超过了x光结晶学中30-40种病毒的数量。尽管其分辨率仍有待提高，但所提供的数据和数据已经成为生命科学中许多研究的非常有价值和重要的基础。一些研究要求甚至得到了满足。将这一研究方法与X射线单晶衍射获得的病毒衣壳的高分辨率三维结构结合起来更有意义。尽管冷冻电子显微镜的计算机重建方法发展历史相对较晚，但它特别有利于研究病毒、核糖体、离子通道等大型复合物和组件的结构和功能。这是结构生物学的一个新发展方向。这些研究都是结构生物学的重要内容。这也是走向一体化的重要一步。人类十大主要疾病，病毒感染性疾病：非典、艾滋病、H5N1、手足口病、肝炎、细菌和真菌感染性疾病：链球菌感染性肺炎、幽门螺杆菌感染性胃炎、足癣糖尿病：1型糖尿病、2型糖尿病和其他癌症：心血管疾病如肺癌、肝癌、胃癌、白血病、淋巴瘤和其他心血管疾病：包括高血压、高脂血症神经退行性疾病：由神经元或其髓鞘丢失和随时间退化引起的功能障碍。关节炎