《基因操作原理》PPT课件.ppt

基因操作原理PrinciplesofGeneManipulation,绪论,一、什么是基因操作,将在细胞外产生的核酸分子插入病毒质粒或其它载体系统中再整合到那些本来不含该类物质的宿主中从而形成一种新的可连续繁殖的有机体,目的,要求掌握基因操作中基本的普遍应用的原理并能自主设计通用操作方法和策略,要求的基础,生物学生物化学分子生物学,参考书籍,.MolecularCloningV2.0,1989分子克隆实验指南2.基因工程原理第二版（上册）吴乃虎科学出版社1998/20003.分子生物学试剂产品目录如NewEnglandBioLabs,其它基因及其操作原理精编分子生物学实验指南Internet,基因及其产物的共线性,基因及其产物的非共线性,基因的重叠与可变性,二、基因的基本概念,编码区ORF启动子promoterRBSribosomalbindingsite终止区terminatorflankingsequenceupstream/downstreamCap/tail,三、基因的基本结构组成,酶切,酶切,连接,转化,筛选,.GAATTC.CTTAAG.,.G.CTTAA,AATTC.G.,EcoRI,三、基因克隆的通用策略,ChromosomeDNA,vector,Recombinantplasmids,Targetgene,第二章工具酶,切割位点可为获得DNA的物理图的特殊的标记利用限制性内切酶切割产生特殊DNA片段的能力使得纯化那些DNA片段成为可能获得的限制性DNA片段可作为DNA操作中的基本介质,第一节限制性内切酶,Restrictionendonuclease,任何物种都有排除异物保护自身的防御机制免疫系统细菌的限制与修饰系统,限制性内切酶修饰酶,一、限制与修饰Restrictionandmodification,50年代初，发现hostcontrolledspecificity噬菌体具有代表性和普遍性其在不同宿主中的转染频率，在感染某一宿主后，再去感染其它宿主时受到限制的现象。,E.coliK,E.coliC,EOP=1,EOP=1,EOP=1,EOP=10-4,1.现象,EOPEfficiencyofplate,pfuplaqueformingunit,E.coliKE.coliBE.coliC,KBC,1,1,1,10-4,10-4,10-4,10-4,1,1,说明K和B菌株中存在一种限制系统可排除外来的DNA10-4的存活率是由宿主修饰系统作用的结果甲基化：AN6甲基-腺膘呤C5甲基胞嘧啶,2.限制酶的发现60年代，限制内切酶和限制酶的概念1968年首次从E.coliK中分离限制性内切酶,需要ATP，S-腺苷甲硫氨酸（SAM）等有特定的识别位点但没有特定的切割位点切割位点达离识别位点1000bp以上,1970年美国约翰霍布金斯大学H.Smith偶然发现流感嗜血杆菌（Haemophilusinfluenzae）能迅速降解外源的噬菌体DNA无细胞提取液可降解E.coliDNA但不能降解自身DNA即HindII酶,5.GTPyPuAC.33CAPuPyTG.5,GTCGACGTTAACGTCAACGTTGAC,YR,5.GAATTC.33CTTAAG.5,EcoRI,3.限制酶的命名,宿主属名第一字母、种名头两个字母菌株或型号序号罗马字HindIIEcoRI,早前加R,orM菌株号和序号小写,1986年下半年发现615R98M1998年10000细菌古细菌3000种酶200多特异性,3.限制与修饰系统的种类亚单位组成,识别序列的种类,是否需要辅助因子分三类(I,II,III)也有分四类，IIs类，即II亚类,(1)typeII93%,识别回文对称序列，在回文序列内部或附近切割3-OH,5-P，需Mg2+，相应的修饰酶需onlySAM识别序列主要为4-6bp，或更长且呈二重对称的特殊序列但有少数酶识别更长的序列或简并序列切割位置因酶而异，有些是隔开的,R:一般为同源二聚体,反向结合作用在两条链M:单体DNA同时切割,M只作用新链,typeIIs占5%识别位点非对称,非间断4-7bp切割位点可能在20bp范围内。R:与typeII具有相同的辅助因子要求M:通常由两个M来完成,各作用一条链,(2)typeI和typeIIItypeI(1%)种类少如EcoREcoB,R酶和M酶各作为一个亚基存在于酶分子中即R基和M亚基，还有负责识别DNA序列的S亚基分别由hsdR，hsdM，hsdS基因编码属于同一操纵子（转录单位）,EcoKR2M2SEcoBR2M4S2,P1hsdRP2hsdMhsdS,识别位点EcoBTGA*(N)8TGCTA*EcoKAAC(N6)GTGCA*甲基化位点可能的甲基化位点切割位点1000bp以外,无特异性,R-M+突变M+,S-R-M-,Genetypephenotype,M-R-M-保全机制,typeIII(6,4Nt=44=2566Nt=46=4096,回文对称46857,2.结构,EcoRIGAATTCCTTAAGHindIIIAAGCTTTTCGAA,非对称AccBSICCGCTC(-3/-3)BssSICTCGTG,2.结构,Numbersinparenthesesindicatepointofcleavagefornon-palindromicenzymes,多识别序列(简并序列)AccIGTMKACHindIIGTYRAC,间断对称AlwNICAGNNNCTGDdeICTNAG,3切割位置内部大多数,AccBSICCGCTC(-3/-3)GGCGAG,AaaaINNNNNN(-2/-4)NNNNNN,例,两端EcoRIICCWGGSau3AIGATCNlaIIICATG,两侧BcgI(10/12)CGA(N)6TGC(12/10),10(N)CGA(N)6TGC(N)1212(N)GCT(N)6ACG(N)10,TspRICASTGNN/NNCAC(G)TGNNNNGTG(C)ACNN,单侧BbvIGCAGCN(8/12)BspMIACCTGC(N4)TGGACG(N8),4.特殊系列I-prefix识别位点外层碱基的随意性;以及单链缺口,EcoRI的研究表明pH的升高和离子强度的降低,可切割N/AATTN切割只有一个碱基不同的序列(但这个变化的碱基在中央序列,以及AATT中不是A到T或T至A的变化),3.引起星星活性的因素高浓度甘油（5%）酶过量（100U/g）低离子强有力度（pH8.0),有机溶剂PMSD(二甲基亚砜)、乙醇、乙二醇、二甲基乙酰胺(dimethylacetamide)、二甲基甲酰胺(dimethylformamide),sulphalane用其它二价阳离子代替Mg+Mn+，Cu+，Co+,Zn+,不同的酶对上述条件的敏感性不一样PstI比EcoRI对高pH更敏感但后者对甘油浓度更敏感,星星活性在绝大多数情况下，是可控制的,4.抑制星星活性的条件（措施）减少酶的用量，避免过量酶切,减少甘油浓度保证反应体系中无有机溶济或乙醇提高离子强度到100150mM(如果不会抑制的话)降低反应pH至pH7.0使用Mg+作为二价阳离子,X174(5386bases)M13mp18(7249bases),WildM13phage6407base,八、单链DNA的切割,Cleavageofsingle-strandedDNA,HinP1I,HhaI,MnlIat50%oftherateofdsDNAHaeIII10%BstNI,DdeI,HgaI,HinfI,TaqI100倍慢不切割：AluI,BbvI,DpnI,FnuDII,FokI,HpaII,HphI,MobI,MobII,MspI,Sau3AI,SfaNI,1.外因反应条件底物的纯度(杂质,污染-盐-酚),九、影响活性的因素,2.“内因”星星活性甲基化底物的构象/位点,1.产生的5突出端补平后连接EcoRIGAATTCCTTAAG,十、酶切位点的引入（酶切水平）,.CTCGAGGAATTCCTGCAG.GAGCTCCTTAAGGACGTC.XhoIEcoRIPstI,.CTCGAGGAATTCCTGCAG.GAGCTCCTTAAGGACGTC.XhoIPstI,.CTCGAGGAATTCCTGCAG.GAGCTCCTTAAGGACGTC.XhoIPstI,AATT,TTAA,.CTCGAGGAATTAATTCCTGCAG.GAGCTCCTTAATTAAGGACGTC.XhoIPstI,AseI,XmnI,酶切补平连接,HindIIIAAGCTAGCTTTTCGATCGAA,AluI,NheI,2.同尾末端的连接BamHI(G/GATCC)+BclI(T/GATCA)AlwI(GGATC4/5),3.平端连接PvuII(CAGCTG)+EcoRV(GATATC)MobI(GATC),十一、酶切位点在基因组中分布的不均一性,GC%,酶切位点出现的机率,BamHIGGATCC,EcoRIGAATTC,在基因组中，碱基对的排列是非均匀的因此尽管GC含量相同的酶切位点，在基因组中出现的机率是不一样的,平均片段大小在E.coliAscI(GGCGCGCC)20kbNotI(GCGGCCGC)200kbEcoRI/HindIII5kbSpeI(ACTAGT)60kb,细菌基因组在大多数富含A+T的细菌中，CCG和CGG的排列是最少见的，所以含有这两种序列的识别序列出现的机率就非常少,酵母基因组G+C%为38%，因此在重复序列之外(tRNAorTyelements)，富含G+C的识别序列就特别少,哺乳动物细胞核基因组的G+C为41%，其中CG的序列比想象的低5倍之多，因此含CG序列的酶切位点在哺乳动物细胞就相当稀少。但是在哺乳动物细胞中，大多数CG序列是甲基化的,第二节甲基化酶Methylase,Methylation,一、甲基化酶的种类,在真核和原核生物中存在大量的甲基化酶，,在E.coli中大多数都有三个位点特异性的DNA甲基化酶,1.Dam甲基化酶,识别位点GATC,在腺嘌呤N6位置引入甲基,PvuIIBamHIBclIBglIIXhoIIMboISau3AI识别位点中含GATC序列ClaI(1/4)XbaI(1/16)TaqI(1/16)MboII(1/16)HphI(1/16)部分识别序列含GATC序列4个ClaI位点(ATCGATN)中有一个该序列,有些限制酶对Dam甲基化敏感不能切割相应的序列BclI,ClaI,MboI,XbaI等不敏感的有BamHI,Sau3AI,BglII,PvuI等,一般哺乳动物DNA不会在A-N6上甲基化当需要在敏感位点上完全切割DNA时，必须从dam-E.coli中提取DNA,2.Dcm甲基化酶,识别CCAGG或CCTGG序列在第二个C上C5位置上引入甲基,EcoRII/BstNICCA(T)GG二者识别序列相同，但切点不同EcoRII受dcm甲基化作用影响BstNI可避免这一影响,受影响酶有：Acc65IGGTACCAlwNIApaIGGGCCCEcoRIIEaeI等,不受影响酶有：KpnIGGTACCBanIIBg1IBstNINarIGGCGCC等,3.EcoKI甲基化酶,识别AAC(N)6GTGCGCAC(N)6GTT但识别位点少(1/8kb)研究较少而dam（1/256bp）dcm(1/512bp),4.SssI甲基化酶,来自原核生物Spiroplasma,CG序列中的C在C5位置上甲基化,可在未甲基化或半甲基化链上起作用,A的N6位置,许多酶对此甲基化敏感AatIIClaIXhoISalI等不敏感的有BamHIEcoRISphIKpnI,SssI甲基化的DNA受E.coliMcrA,McrBC,Mrr系统的限制,5.其它甲基化酶,二、依赖于甲基化的限制系统,E.coli中至少有3种依赖于甲基化的限制系统识别的序列各不相同，但只识别经过甲基化的序列,mcrA,mcrBC,mrr,都限制由CpG甲基化酶(MSssI)作用的DNA,Mrr也限制m6A,McrBC切割两套位点（G/A）mC，这两套位点之间间隔2kb，最适为55103bp，需GTP,大多数常用的E.coli受体都含这三个限制系统三个都不限制Dam,EcoKI,EcoRI修饰的位点McrA限制HpaII甲基化修饰的位点,三、甲基化对限制酶切的影响,1.修饰酶切位点,HincIIGTCGACGTCAACGTTGACGTTAAC,M.TaqI甲基化TCGA中的A，所以M.TaqI处理DNA后，GTCGAC将不受HincII切割,BamHIGGATCCM.MspIm5CCGG如果BamHI前面为CC或后面为GG，那么M.MspI处理的DNA抵抗BamHI的切割,构建DNA文库时用AluI(AGCT)和HaeIII(GGCC)部分消化基因组DNAM.EcoRI甲基化酶处理，然后加上合成的EcoRI接头当再用EcoRI来切割时只有接头上的位点可被切割,2.产生新酶切位点TCGATCGAAGCTAGCTTaqITaqIM.TaqITCGA*TCGA*AGCTAGCTDpnI,3.用于研究细胞DNA中位点特异性甲基化的水平及分布哺乳动物m5CG、植物的m5CG，m5CNG肠道细胞的Gm6ATCCm5/4CGGMspI可切割，HpaII不可切割Gm6ATCSau3AI可切割，MobI不可切割其它,4.对基因组作图的影响,在哺乳动物DNACpG序列出现的频率大约只有预计的1/5含CpG序列的识别序列极其稀少,大多数CpG都发生甲基化含CpG的所有识别序列的酶不能切割,CpG甲基化大多数不完全对酶切位点稀少的酶来说在其识别位点上的甲基化具可变性,第三节DNA聚合酶,DNApolymerase,催化DNA的合成(模板/引物/dNTP等)及其相辅的活性,一、大肠杆菌DNA聚合酶I,真核细胞有4种DNApoly：也许是复合物，位于细胞核内，有催化细胞增生的作用。：小分子蛋白质（4.4kDa）曾从小牛胸腺出大是出，与细胞增生无关。：100kDa，利用RNA为模板的效率比利用DNA为模板的效率高。其它：线粒体DNA聚合酶、催化线粒体DNA的合成。,原核细胞三种DNA聚合酶，都与DNA链的延长有关I单链多肽，可催化单链或双链DNA的延长II与低分子脱氧核苷酸链的延长有关III在细胞中存在的数目不多，是促进DNA链延长的主要酶,1.活性,单链多肽(109kDa)三种活性,53DNA聚合酶活性底物:模板(ssDNA),引物（带3OH基）或5突出DsDNA,Mg2+dNTPDNApolyI,53外切核酸酶活性底物:dsDNAorDNA:RNA杂交体活性：从5端降解dsDNA，也降解RNA:DNA中的RNA(RNaseH活性),Mg2+DNApolyI,+dNTP,35外切酶活性底物：3-OHdsDNAorssDNA活性：从3-OH端降解DNA，可被53聚合活性封闭。,Mg2+DNApolyI,+dNTP,Mg2+DNApolyI,+dNTP,Proofreading,反应平衡,过量dNTP平端,2.用途切口平移法标记DNA（所有DNApoly中只有该酶有此活性）,Mg2+,低限量DNaseI,dNTPDNApolyI,产生切口,切口平移外切活性和合成活性共同作用使切口沿5-3方向平移,若有放射性dNTP,则可标记成探针,用于cDNA克隆中的第二链即单纯的DNA聚合活性但由于有5-3外切活性，已不再使用，而改用Klenow酶和反转录酶,末端标记（交换或置换反应）,Mg2+,DNApolyI-P32dATP,A*T,T4DNApolyT7DNApoly更好,二、Klenow酶,E.coliDNApolymeraseIlargefragmentKlenowfragment,在蛋白酶（枯草杆菌蛋白酶）裂解,从全酶中除去53外切活性片段，而聚合活性和35外切活性不受影响，或基因工程而得76kDa,1.活性共两种,同DNApolyI,2.作用补平3凹端，注意要用dNTP抹平3凸端，注意必须加足量dNTPT4和T7具更强3-5外切活性，被取代末端标记A置换反应同前,同样被T4poly代替B补平3-凹端的过程进行标记,cDNA克隆中合成第二链随机引物标记DNA测序（Sanger双脱氧链末端终止法）被T7取代，Taq等PCR酶。PCR反应被Taq等取代在体外诱变中，用于从单链模板合成dsDNA,仅利用DNA合成活性,三、T4噬菌体DNA聚合酶,T4DNApolymerase,来源于T4phage感染的E.coli,114kDa,1.活性与Klenow酶相似,但35外切活性强200倍不从单链DNA模板上置换引物因此在诱变反应中更有用,2.用途补平或标记3凹端必须有高浓度dNTP（末端标记）置换反应必须有高浓度dNTP(一种),末端标记,标记DNA片段即利用外切活性产生了3凹端再补平（用标记的dNTP）,与切口平移相比有两大优点：不产生发夹结构经限制酶切割后易变成链特异性探针缺点：标记不均匀，且35外切活性强且快，当外切至中点时必须终止，否则变成二单链，而被降解,将dsDNA变成平端，需高浓度dNTP定点诱变在ssDNAdsDNA过程中由于T4不置换引物，效率提高1倍。,四、T7噬菌体DNA聚合酶,T7DNApolymerase,来源于T7phage感染的E.coli,为两种紧密结合的蛋白质复合体(基因5蛋白和宿主的硫氧还蛋白),T7DNApoly为持续合成能力最强的一个平均长度要大得多,在测序时具有优势活性/功能与T4DNApoly、Klenow类似但35外切活性长Klenow的1000倍,修饰的T7DNApolymerase99%3-5外切活性被除去（Version1.0）完全除去（V2.0）用于测序反应（测序酶）SequenaseUSBBiochemical,用途:A.替代T4的功能B.长模板的引物延伸,五、耐热DNA聚合酶,简略，详见PCRTaq,Vent,Pfu,Pwo,Tth等,六、反转录酶Reversetranscriptase,依赖于RNA的DNA聚合酶,1种类来自AMV禽成髓细胞瘤病毒Mo-MLV(或称M-MuLV)Moloney鼠白血病病毒,53合成DNA无35外切活性,AMV二链多肽(62kDa/94kDa),具53DNA聚合活性具很强的RNA酶H活性(降解与DNA杂交的RNA),在反应开始时,引物和mRNA模板杂交体可成为RNaseH的底物,此时模板的降解和cDNA的合成相竞争,反应终止时，RnaseH可在正在增长的DNA链近3端切割模板趋向于抑制cDNA的产量并限制其长度,但在42(鸡的正常体温),能有效发挥DNA合成作用，能有效地拷贝较复杂的mRNA早期提纯过程中易被内切酶污染,cDNA不超过1kb,现已解决,M-Mulv单肽84kDaRNaseH活性弱利于合成较长cDNA纯度高工程产品42失活,2用途cDNA克隆测转录起始点（引物延伸法）5突出DNA的补平测序反应,当用DNApolyI,Klenow或测序酶不理想时其它RT-PCRRNA二级结构,3.活性53DNA聚合活性（Mg+）RNAorDNA模板,带3OH的RNA或DNA引物RNaseH活性,4.注意事项无35外切校正作用，在高dNTP和Mn2+时，每500个bases会有一个误掺入。为防止新合成的DNA提前终止，需高浓度dNTP。单链拷贝，也可双链合成（自身序列为引物，但效率低）,50g/ml放线菌毒D，抑制第二链合成。,七、末端转移酶,来源于小牛胸腺,存在于前淋巴细胞及分化早期的类淋巴样细胞内的一种不寻常的DNApoly在二价阳离子存在下，末端转移酶催化dNTP加于DNA分子的3羟基端T,C首选Co2+A,G首选Mg2+,Terminaltransferase,1.底物DNA,可短至3个核苷酸,3突出低离子强度时,平端或3凹出端DNA亦可但效率低2.用途在3端加同聚尾，cDNA或载体，用于克隆，或标记末端标记ddNTP(标记的),3715min随时间的延长尾亦长。,3.同尾的长度,第四节RNA聚合酶RNApolymerase,来源于噬菌体感染宿主后所产生,SP6噬菌体聚合酶:来源于感染鼠伤寒沙门氏菌LT2菌株T7或T7噬菌体聚合酶:来源于感染的大肠杆菌,1.活性这些RNA聚合酶实际上为转录过程中RNA合成的酶，识别DNA中特异的启动子序列，并沿此dsDNA模板起始RNA的合成。与DNA聚合酶不同，无需引物，但识别特异性位点,2.用途体外：将这些RNA聚合酶特异性的启动子安装在载体,如pGEM-3Z载体(2.74kb,p13)中，用于体外转录（合成）与外源DNA同源的RNA，从而用作杂交探针，体外翻译系统中的mRNA，体外剪接反应的底物,体内：用于表达外源基因A.Ecoli先构建宿主菌，将T7polyRNA基因置于lacUV5启动子之下，插入到噬菌体中，感染E.coli建立稳定的溶原菌,EcoliBL21(DE3)：lacUV5启动子+T7RNA聚合酶基因，置于噬菌体DE3区，该区整合于染色体的BL21处。,若将T7噬菌体启动子控制的目的基因经质粒载体导入该宿主菌中在IPTG(异丙基硫代-D-半乳糖苷)诱导启动外源基因的表达,另一种方法是，先导入重组质粒，再用（带T7RNApoly）感染，激活目的基因的表达,B酵母菌酵母启动子+T7RNApolyin稳定载体T7启动+外源基因in另一载体,第五节连结酶(Ligase),将两段核酸连接起来的酶,催化DNA5磷酸基与3羟基之间形成磷酸二脂键,1.T4DNAligase68kDaT4噬菌体感染大肠杆菌产生,底物：DNAorRNA(效率低)粘端，切口，平端,影响因素：PEG（低浓度）10%单价阳离子（150-200mMNaCl）提高平端连接速率,Weiss单位在37下20min催化1nmol32p从焦磷酸根置换到,-32PATP所需的酶量。,NEB单位(NewEnglandBiolabs)20l,16,30min,300g/ml(0.12M5末端)/HindIII,连接50%所需的酶量,/HindIII(7个切点)23.1(kb)9.46.64.42.32.0564(bp)125,48502bp,1Weiss=67粘端连接单位(NEB单位)(Molecularcloning写为60NEBunit),1NEB单位=0.015Weiss单位,条件(需ATP)164hr4overnight,5min连接T4DNAligaseRoomtemperature(BoehringerMeinnham公司),2.E.coliDNA连接酶与T4DNAligase相似,但需烟酰胺-腺嘌呤二核苷酸(NAD+)参与平端连接效率低，用于置换合成法作cDNA克隆（不将RNA连接到DNA,不连接RNA）,3.TaqDNA连接酶在两个寡核苷酸之间连接同时必须与另一DNA链形成杂交体相当于连接dsDNA中的缺口作用于4565需NAD+在PCR扩增中引入寡核苷酸不可替代T4DNALisase用于检测等位基因的变化/定点诱变,4.T4RNA连接酶催化ssDNA或RNA的5-磷酸与3羟之间形成共价连接,DNADNA5P+3-OHorpNpRNARNA,用途：标记RNA的3末端单链DNA或RNA连接合成寡核苷酸,第六节核酸酶(nuclease),一、BAL31核酸酶来源于AlteromonasespejianaBAL3主要活性为3外切核酸酶活性，可从线性DNA两条链的3端去掉除单核苷酸，还是一个内切核酸(单链，nick,gap)依赖Ca+EGTA可抑制活性,连续去除3端单核苷酸后形成的单链DNA，可被内切核酸活性降解,用途：从两头缩短DNA(用于缺失突变等），活性发挥均匀，活性与酶浓度成线性关系确定DNA二级结构DNA限制酶切图,注：可能有单链突出，可用DNApoly补平，单链突出的长度与酶浓度有关，如：2-5u/ml,平均有5个bases单链，10-20%保持平端,二、Sl核酸酶来源于米曲霉(Aspergillusoryzae)降解单链DNA或RNA，产生带5磷酸的单核苷酸或寡核苷酸对dsDNA，dsRNA；DNA:RNA不敏感酶量大可完全消化双链，中量，可在切口或小缺口处切割双链作用：用于分析DNA:RNA杂交体的结构去掉突出的单链尾，以产生平端打开双链cDNA合成中产生的发荚环,三、绿豆核酸酶MungBeanNuclease来源于绿豆芽与Slnuclease相似但比Sl更温和在大切口上才切割可使DNA突出端变成平端,CCAAGCTTGGGGTTCGAACC,CCAAGCTTGGGGTTCGAACC,CCATGGGGTACC,HindIII,MBN,CCATGGGGTACC,NcoI,四、核糖核酸酶ARNaseA（来源于牛胰）内切核酸酶可特异攻击RNA上嘧啶残基的3端形成带嘧啶3磷酸的单核苷酸或末端带嘧啶3磷酸的寡核苷酸,用途：除去DNA样品中的RNA除去DNA:RNA中未杂交的RNA区确定杂交体DNA的RNA中单突变的位置可能污染其它酶（如DNA酶）使用前应加热,五、DNaseI(来源于牛胰)内切酶，可优先嘧啶核苷酸水解dsorssDNAMg2+:独立作用于每条DNA链，位点随机Mn2+:大致在同一位置切割dsDNA产生平端或1-2个核苷酸突出,用途：切口平移标记，在dsDNA上随机产生切口在闭环DNA上引入单切口以使分子截短（在亚硫酸氧盐介导的诱变前）建立随机克隆，以便安插在M13phage上测序分析蛋白:DNA复合物（DNA酶足迹法）除去RNA样品中的DNA（RNase-free）,六、外切核酸酶III（来源于大肠杆菌）exonucleaseIII,ExoIII.活性催化从dsDNA3-OH逐一去除单核苷酸底物为dsDNA线状或带切口或缺口的环状DNA，结果是在dsDNA上产生长的单链区。无嘌呤DNA特异性内切核酸酶活性,RNAaseH活性3-磷酸酶活性(去磷酸),但不降解磷酸二脂链,不降解单链DNA及3突出dsDNA持续作用能力不强，产物为长短不相上下的群体，有利于分离长短不等的DNA。,2用途：制备部分截短的DNA,用作探针（Klenow补平）,类似T4poly的作用在dsDNA链上产生末端序列嵌套缺失的成套缺失体一般与绿豆核酸酶或Sl核酸酶联合应用也能制备单向缺失的DNA（如另一端为3突出端）定点诱变,选用dNTP的硫代磷酸衍生物在诱变引物引导下合成第二链，该酶可用于切割模板链(不切割硫酯键),以提高转化突变率,RNaseT1为内切RNase,作用于鸟嘌呤3磷酸,phage外切核酸酶作用于dsDNA持续逐一释放5单核苷酸最适底物为带5磷酸的dsDNA,也可作用于ssDNA(1/100活性)切口或缺口dsDNA不作用，现应用较少,七、RNaseH内切核酸酶，特异性水解与DNA杂交的RNA上的磷酸二脂键，产生3-OH和5P末端的产物不降解，单链核酸，dsDNAordsRNA用途：在cDNA克隆，合成第二键之前去除RNA用脱氧核苷酸指导在特异位点切割RNA分析体外多聚腺嘌呤反应的产物，在与Olig(T)orploy(dT)杂交后，去掉poly(A)尾,八、RNaseOneTM27kDaPromega公司降解RNA至小分子，以至3NMPs是唯一可在所有4个碱基处切割磷酸二脂键由于可来自基因工程产品无其它DNA切割活性，无需boiling,第七节其它酶,一、T4多核苷酸激酶T4polynucleotidekinase催化ATP的-磷酸基转移至DNA或RNA的5末端还具有3磷酸酶活性*：高浓度ATP发挥最佳活性。NH4+强烈抑制剂,5凸出单链效率高,交换反应：用于标记5末端，制备探针过量的ATP可使该激酶将磷酸化的5端磷酸转移给ADP，然后DNA从-32pATP中获得放射性标记的-磷酸而重新磷酸化,正反应：ATP的-磷酸基被转移到去磷酸化的DNA5端，用于对缺乏5-磷酸的DNA进行磷酸化。以致可用于DNA连接,Maxam-Gilbert测序Sl酶分析,5pDNA+ADP5p*DNA+ADP+ATP,-32pATP(过量),T4kinase,二、碱性磷酸酶AlkalinePhosphatase主要来源于牛小肠CalfIntestinalMucosa种类：牛小肠碱性磷酸酶（CIP，CIAP）细菌碱性磷酸酶（BAP）活性：除去DNAorRNA5磷酸用途：主要用于防止DNA片段自身环状，以及标记前（5端）除5磷酸灭活：BAP抗性强、抗高温和去污剂。CIP可用蛋白酶K消化，或在5mMEDTA时651hr(或7510min),再酚:氯仿抽提,三、琼脂糖酶(-agaraseI,NEB)活性：切割琼脂糖亚单位unsubstitutedneoagarobiosetoneoagarooligosaccharides)Promega:AgarACEenzyme作用于低溶点琼脂糖，40(液体状)incubationGellingpoint25(26-30);Meltingpoint65用于分离大片段DNA,四、DNA结合蛋白1.单链DNA结合蛋白（SSB）能协同地与ssDNA结合而不与dsDNA结合,可以削弱链内二级结构的稳定性两种SSB，来自E.coli；T4phage32蛋白用途：用于DNA的电镜观察即更好地区分单链和双链增强DNA聚合酶合成长链产物定点诱变,DNA测序,刺激PCR,2.RecA蛋白（E.coli）37.842kDa由recA基因编码，与重组有关RecA蛋白可与单链DNA结合，还可促进dsDNA对同源的ssDNA的吸收作用还是一个依赖于DNA的ATP酶。,五、RNase抑制剂RibonucleaseInhibitorPromega：RNasin，50kDa,from人类胎盘Pharmacia:RNAgard活性：为RNase的非竞争性抑制剂非共价方式结合在RNase-A类的酶上用途：cDNA合成（如反转录）RT-PCR体外转录和体外翻译,六、其它1.拓扑异构酶I（小牛胸腺）通过瞬时破坏并再生磷酸二酯键，解除共价闭环dsDNA中的超螺旋。2.溶菌酶3.蛋白酶K,第三章常用载体,Vehicle,将外源DNA或基因携带入宿主细胞（hostcell）的工具称为载体,载体应具备以下特点：1在宿主细胞内必须能够自主复制（具备复制原点）,2必须具备合适的酶切位点，供外源DNA片段插入，同时不影响其复制,3有一定的选择标记，用于筛选,其它：有一定的拷贝数，便于制备,利用重组DNA技术分离目的基因，称之为基因克隆,克隆动词：指从单一祖先产生同一的DNA分子群体或细胞群体的过程,名词：指从一个共同祖先无性繁殖下来的一群遗传上同一的DNA分子、细胞或个体所组成的特殊的生命群体。,载体的类型：质粒plasmid噬菌体phage粘粒载体cosmid噬菌粒phagemid,由大量的含有基因DNA（即某一生物的全部DNA顺序）的不同DNA片段的克隆所构成的群体，称之为基因文库引自分子生物学，阎龙飞、张玉麟主编，北京农业大学出版社，1993,一、质粒的基本特性,第一节质粒载体Plasmidvectors,1概念染色体外的遗传因子，能进行自我复制（但依赖于宿主编码的酶和蛋白质）大多数为双链，闭环DNA分子，少数为线性大小1kb200kb,也有更大,质粒的表型:抗生素的抗性、产生抗生素、降解复杂有机化合物产生毒素（如大肠杆菌素，肠毒素），限制酶与修饰酶、固氮、杀虫等,复制子有不同的组成方式（滚环、以及G+/G-）在Ecoli中，使用的大多数载体都带有一个来源于pMB1质粒或ColE1质粒的复制子其复制方式如下：,RNAII,ori,-550,600,400,Rop,RNAI,RNaseH,2质粒的复制复制起始区:通常一个质粒含有一个与相应的顺式作用控制要素结合在一起的复制起始区,合成RNAII即前引物，形成杂交体RNaseH切割RNAII使之成熟，形成三叶草结构RNAI可控制RNAII形成二级结构Rop增强RNAI的作用,拷贝数严谨型：拷贝数有限，大约1几个构驰型：拷贝数转多，几十至几百,削弱RNAI和RNAII之间相互作用的突变，将含增加带有pMB1或(ColE1)复制子的拷贝数，(突变位置位于rop基因或编码RNAI和RNAII的复制起点内),RNAI的起点上游1个核苷酸G变成了A，从而使得其转录起点改为下游3个核苷酸处(由于RNAI5单链的完整对于RNA/RNAII间的相互作用至关重要因此，pUC质粒拷贝数的增加看来很可能是由于)缩短的RNAI与RNAII的结合效率降低所致,pUC质粒拷贝数高是由于RNAI的起点上游1个核苷酸G变成了A，从而使得其转录起点改为下游3个核苷酸处，由于RNAI5单链的完整对RNA/RNAII间的相互作用至关重要因此，pUC质粒拷贝数的增加看来很可能是由于缩短的RNAI与RNAII的结合效率降低所致,pMB1质粒的复制并不需要质粒编码的功能蛋白，而是完全依靠宿主提供的半衰期较长的酶（DNA聚合酶I，DNA聚合酶III），依赖于DNA的RNA聚合酶，以及宿主基因dnaB,dnaC,dnaD和danZ的产物,因此，即使蛋白质合成并非正在进行，复制依然能够我行我素,当存在抑制蛋白质合成并阻断细菌染色体复制的氯霉素或壮观霉素等抗生素时，带有pMB1(或ColE1)复制子的质粒将继续复制，最后每个细胞中可积聚2-3千个质粒。,3质粒的不相容性两个质粒在同一宿主中不能共存的现象称质粒的不相容性在第二个质粒导入后，在不涉及DNA限制系统时，不相容的质粒一般为利用同一复制系统，质粒分配到子细胞时会发生竞争，随机挑选，微小差异，最终放大。不相容群：指那些具有不相容性的质粒组成的一个群体，一般具有相同的复制子ColE1/pMB1现已发现30多个不相容群，ColE1/pMB1pSC101,p15A,4转移性在自然条件下，很多质粒可以通过称为细菌接合的作用转移到新宿主内要素：移动基因mob，转移基因tra，转移起始位点如：F质粒pBR322有起始位点bom的nic位点，可在第三个质粒（如ColK）编码的转移蛋白作用下，通过接合性质粒来进行转移。但大多数载体无nic/bom位点（pUC）,1.选择标记用于鉴别目标DNA的存在，将成功转化了质粒的宿主挑选出来,二、标记基因,(1)氨苄青霉素抗性基因AmpRamprampicillin青霉素抑制细胞壁肽聚糖的合成，与有关的酶结合,抑制转肽反应并抑制其活性AmpR编码一个酶，可分泌进入细菌的周质区，并催化-内酰胺环水解，从而解除了氨苄青霉素的毒性,青霉素是一类化合物的总称，其分子结构由侧链R-CO-和主核6-氨基青霉烷酸（6-APA）两部分组成。在6-APA中有一个孢和的噻噬环（A）和一个-内酰胺环，6-APA由L-半脱氨酸和缬氨酸缩合成的二肽,(2)四环素抗性基因tetrtetracycline与核糖体30S亚基的一种蛋白质结合，从而抑制核糖体的转位tetr基因编码一个由399aa组成的膜结合蛋白，可阻止四环素进入细胞。,(3)氯霉素抗性基因chloramphenicol,CmrorCatCm与核糖体50S亚基结合并抑制蛋白质合成目前使用的Cmr来源于转导性P1噬菌体(也携带Tn9)cat基因编码一个四聚体细胞质蛋白(每个亚基23kDa)，氯霉素乙酰转移酶，在乙酰辅酶A存在的条件下，催化氯霉素羟乙酰氧基衍生物的形成，该产物不能与核糖体结合,该酶的表达对分解代射的产物敏感，若细菌利用除葡萄糖以外的碳源生长时，其表达量可增加到原来的5-10倍，在cAMP/分解代射的产物基因激活蛋白存在下，依赖于DNA的RNA聚合酶在体外与cat基因启动子结合的能力明显增强。,(4)卡那霉素和新霉素抗性基因kanamycin/neomycin可与核糖体成分相结合并抑制蛋白质合成的脱氧链霉胺氮基糖苷这两种抗生素可被氨基糖苷磷酸转移酶（APH(3)-II）所灭活，该酶为25kDa，似乎位于外同质腔，这些抗生素的磷酸化干扰了它们向细胞内的主动转移。,(5)SupF琥珀突变抑制基因终止密码：UAA(赭石),UAG(琥珀),UGA(乳白),supF编码细菌的抑制性tRNA在某一宿主中含具琥珀突变的tetr和ampr，只有当含supF的质粒转入后，宿主才会对Amp和tet具抗性，supF在UAG上加入酪氨酸，supE加入谷氨酰氨如AN13,0.895kb,(6)其它正向选择标记质粒可表达一种使某些宿主菌致死的基因产物，而含有外源基因片段插入后，该基因便失活,2.筛选标记,(1)-互补-complementationLacZ基因的互补,-galactosidase1024aa,LacZ,LacZM15,LacZ,140个aa,编码缺失第11-41位氨基酸,140个aa+MCS,IPTG:异丙基-D-硫代半乳糖苷诱导物X-gal:5-溴-4氯-3吲哚-D-半乳糖苷底物(生色剂),-半乳糖苷酶分解x-gal形成蓝色产物,MCS:Multiplecloningsites,LacZM15,LacZ,IPTG/x-gal,LacZM15LacZ,蓝色,LacZM15LacZDNA,IPTG/x-gal,白色,在载体中加入一个短区段，含LacZ基因的调控区和头140个aa的编码信息，在这个编码区中插入了一个多克隆位点，它并不破坏阅读框架，相当于在-半乳糖苷酶的氨基端插入了几个氨基酸，而不影响未加几个氨基酸时的功能。laczM15编码缺失第11-41位氨基酸的-半乳糖苷酶，但无酶学活性。,当lacZ与laczM15的产生混合在一起时却有酶学活性，所以在载体上加lacZ/(MSC)，并在受体菌中引入laczM15即可实现-互补。,在生色底物（x-gal）存在下形成兰色菌落，而外源基因插入到质粒的多克隆位点后，几乎不可避免地导致产生无-互补能力的氨基端片段。,-互补lacZ基因上缺失近操纵基因区段的突变体与带有完整的近操纵基因区段的-半乳糖苷酶阴性的突变体之间实现互补,LacZM15放在F质粒上,随宿主传代LacZ放在载体上,作为筛选标记,(2)插入失活,相应的受体菌TG1,XL1-Blue,JM101等,(lac-proAB)FproAB+lacIqlacZM15,lacI:LacZ阻抑物的编码基因（lacIq突变使阻抑物产量增加）,三、质粒载体的种类pBR322之前pSC101,ColE1等,大且酶切位点少转化效率与大小成反比15kb转化效率成为限制因素质粒越大，越难于用限制酶切因素进行鉴定质粒越大，拷贝数就越低,pBR322以后，调整载体的结构，提高载体的效率pBR322pUC质粒去掉多余片段，提供多克隆位点，筛选标记增加辅助功能/表达载体，穿梭载体,1克隆载体用于扩增or保存DNA片段，最简单的载体pBR3224361bp，许多质粒载体由此发展而来，GenBankV01119,J01749(4361bp)含有30多个单一位点，且Ampr和tetr可通过插入失活进行筛选,pUC18/192686bp18:L0875219:X02514来自pBR322其中LacZ(MSC)来自M13mp18/19MSC(10个位点),-互补cloning:expression:利用lacZpromotorsequencing:UniversalandReserveprime引物位置/引物序列,Multiplecloningsites,ForwardUniversalprimer,Reverseprimer,pUC118/119118:UO76493162bp/119:UO76503162bp带有M13噬菌体DNA合成的起始与终止以及包装进入噬菌体颗粒所必需的顺式序列，当含这些质粒的细胞被适当的丝状噬菌体感染时，可合成质粒DNA的其中一条链，并包装子代噬菌体颗粒用途:分离ssDNA测序，诱变，探针,噬菌粒,体外转录pGEM-3Z/4Z：3Z：X653044Z：X65305,综合性载体pTZ18/19/U/RpTZ18UL37352(2860bp)pTZ18RL08956(2871bp)pTZ19RL08957pTZ19UY14836(2862bp)L37382(2863bp)pGEM-3Zf3.2kbpGEM-3Zf(-)X65307pGEM-3Zf(+)X65306BluescriptM132979bpSK(-)X52324/SK(+)X52325SK(-)X52326/SK(+)UIISK(+)X52328/IISK(-)X52330IISK(+)X52327/IISK(-)X52329,载体应具备以下特点：1在宿主细胞内必须能够自主复制（具备复制原点）2必须具备合适的酶切位点，供外源DNA片段插入，同时不影响其复制3有一定的选择标记，用于筛选其它：有一定的拷贝数，便于制备,附加因素:MSC,LacZ(-互补),ssDNAphageorigin,Promoters，以及cos位点等,2.表达载体p35s-GFP(U28417,4518bp)等，详见后文,第二节phagevectors,1.最早使用的克隆载体并对其遗传学和生理学作了深入研究2.为利用该载体必须熟知其分子生物学，了解载体的设计和组建的原则,一、噬菌体的分子生物学48502bpGenBankJ02459orM172335strandoverhangsthe3strandby12basesGGGCGGCGACCT,/HindIII(7个切点)23.1(kb)9.46.64.42.32.0564(bp)125,48502bp,（一）发育调节1.吸附37正常，室温无噬斑2早期转录立即早期、延迟早期N：正调节子使PL和RR继续转录(中和-因子的活性)Cro：抑制PL