微生物限度检测方法验证操作规程(2015年版)

微生物限度检查方法验证操作规程一个目的确认所采用的方法适用于该产品的微生物限度检测。2根据中国药典 2015版。3个范围所有需要微生物限度检查的产品。4责任4.1验证小组负责验证方法验证/确认方案的起草、验证/确认方案的实施。4.2验证委员会负责验证/确认方案的审查、验证/确认结论的审查。五个程序5.1验证小组提出验证申请，验证方案制定完成后，填写确认和验证方案审批表，验证小组签署，报告验证委员会审查，生产责任人和质量责任人批准后，验证方案制定人员可以训练验证小组的剩馀人员，根据验证方案进行考试。5.2试验完成后，可立即制作验证报告，填写验证报告审批表，经验验证小组签署，报告验证委员会审查，生产负责人和质量负责人批准后，实施验证报告结论。6内容6.1概要通过验证，证实了所采用的方法适用于该产品的好氧菌总数、霉菌和酵母菌总数的测定及菌的检测。 根据样品特性制定检验方法和检验条件，按制定的方案进行试验，根据检验结果判断是否符合检验标准。 如果符合，在验证的方法和条件下进行产品的微生物限度检查，不符合的情况下，重新制定检查方法和检查条件，验证结果到达设定的验证基准为止。6.2好氧细菌总数、霉菌和酵母菌总数计数方法验证6.2.1验证用菌株铜绿假单胞菌CMCC(B)10 104金黄色葡萄球菌CMCC(B)26 003枯草芽孢杆菌CMCC(B)63 501曲霉CMCC(F)98 003念珠菌CMCC(F)98 0016.2.2验证用菌液的制备将6.2.2.1铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌接种到胰大豆胨液体培养基中，在3035下培养1824小时。 每次采集1ml上述培养物，用0.9%无菌氯化钠溶液或pH7.0无菌氯化钠胨缓冲液制成适当浓度的菌悬浊液，进行预备。6.2.2.2将念珠菌接种到萨尔维亚液培养基中，在2025下培养23天。 取上述培养物1ml，用0.9%无菌氯化钠溶液或pH7.0无菌氯化钠胨缓冲液制备适当浓度的菌悬浮液，进行预备。将6.2.2.3曲霉接种到糖精琼脂培养基中，在2025下培养57天，加入含0.05%(ml/ml )聚山梨脂80的0.9%无菌氯化钠溶液或pH7.0无菌氯化钠蛋白缓冲液，洗脱孢子。 然后，用适当的方法将孢子悬浮液吸入无菌试管内，用含有0.05%(ml/ml )聚山梨脂80的0.9%无菌氯化钠溶液或pH7.0无菌氯化钠胨缓冲液制作适当浓度的孢子悬浮液，进行预备。6.2.3供试液的制备6.2.3.1水溶性供试品取供试品，用pH7.0无菌氯化钠-胨缓冲液或干酪大豆胨液体培养基溶解或稀释，制成1:10供试液。 根据需要，将供试液的pH调整为68。 必要时，用同一稀释液将供试液再稀释10倍系列。 也可以将混合了水溶性液体制剂的试验品原液用作试验液。6.2.3.2水不溶性非油脂类的供试品取供试品，用pH7.0无菌氯化钠-胨缓冲液或干酪大豆胨液体培养基溶解或稀释，制成1:10供试液。 分散力低的试验品可以在稀释液中加入表面活性剂，例如0.1的聚山梨80，使试验品均匀分散。 根据需要，将供试液的pH调整为68。 必要时，用稀释液将供试液再稀释10倍系列。6.2.3.3油脂类的供试品取样品，加入无菌十四烷酸异丙酯使其溶解，或者与最少量即可乳化样品的无菌山梨酯80和其他无菌表面活性剂充分混合。 表面活性剂的温度一般在40(特殊情况下最大为45)以下，小心混合，根据需要在水浴中进行，加入预热的稀释液，以1:10供给试验液，保温、混合，在最短时间内形成乳液。 根据需要用稀释液或含有上述表面活性剂稀释液进一步稀释成10倍系列.6.2.3.4肠溶性制剂的供试品取供试品10g，加入pH6.8的无菌磷酸盐缓冲液，放入45的水浴中振荡、溶解，制成1:10的供试液。 必要时，用稀释液将供试液再稀释10倍系列。6.2.4接种和稀释如下进行供试液接种和稀释，制备微生物回收试验用供试液。 加入的菌液体积不得超过供试液体积的1%。 为了确认供试品中的微生物被充分检测出来，首先选择最低稀释级的供试液进行计数方法的适用性试验。6.2.4.1试验组采集上述制备的供试液，加入试验菌液混合，使每1ml供试液或每1张过滤膜的供试液所含菌量在100cfu以下。6.2.4.2供试品对照组取制备的供试液，用稀释液代替菌液与试验组操作。6.2.4.3菌液对照组取代试验液不含中和剂和灭活剂的相应稀释液，通过试验组的操作加入试验菌液进行微生物回收试验。供试品的抗菌活性和溶解性差，不能选择最低稀释级的供试液进行方法适应性试验的，应用适当的方法进一步处理供试液。 供试品抑制微生物生长的作用无法通过其他方法消除时，供试液经中和、稀释或薄膜过滤处理后，可加入供试菌悬浊液进行方法的适用性试验。6.2.5除去或灭活抗菌活性供试液接种后，按照以下微生物回收中规定的方法进行微生物计数. 试验组菌落数减去试验品对照组菌落数的值不足菌液对照组菌落数的50%时，可通过下述方法去除试验品的抗菌活性。6.2.5.1增加稀释液或培养基的体积。6.2.5.2加入适当的中和剂或灭活剂。中和剂和灭活剂(表1 )可用于去除干扰物的抗菌活性，但希望在稀释液和培养基灭菌前添加。 使用中和剂或灭活剂时，试验中应设置中和剂或灭活剂对照组。 即用稀释液代替供试剂与试验组操作，确认其有效性和微生物无毒性。 中和剂或灭活剂对照组菌落数与菌液对照组菌落数之比应在0.52的范围内。表1常见干扰物的中和剂或灭活方法干扰物可选择中和剂或灭活方法戊二醛、汞制剂亚硫酸氢钠酚类、乙醇、醛类、吸附物稀释法醛类甘氨酸季铵化合物、对羟基苯甲酸、双胍系化合物卵磷脂季铵化合物、碘、对羟基苯甲酸波利山梨汞巯基乙酸盐汞、汞化物、醛类硫代硫酸盐EDTA，喹诺酮类抗生素镁离子或钙离子磺胺类药物对氨基苯甲酸-内酰胺类抗生素内酰胺酶6.2.5.3采用薄膜过滤法。6.2.5.4上述几种方法的并用。没有适当消除试验品抗菌活性的方法，特定试验菌回收失败，表明试验品对该试验菌具有较强的抗菌活性，同时也表明试验品不易被这种微生物污染。 但供试品只对特定试验菌株有抑制作用，对其他菌株无抑制作用。 因此，应根据供试产品必须符合的微生物限度标准和菌数报告规律，在不影响检测结果判断的前提下，应用使微生物生长的更高稀释水平的供试液进行计数方法的适用性试验。 方法适用性试验满足要求时，以该稀释级供试液为最低稀释级供试液进行供试验品检验。6.2.6供试品中微生物的回收计数方法适用性试验用的各试验菌应逐一进行微生物回收试验。 微生物的回收可采用平皿法、薄膜过滤法、MPN法。6.2.6.1平皿法平皿法包括浇注法和涂布法。 每株试验菌按培养基至少配制2个平皿，根据算术平均值计数结果。6.2.6.1.1倒入法取上述“供试液的制备”“接种和稀释”和“除去或灭活抗菌活性”中制备的供试液1ml，可放置直径90mm的无菌平盘，注入温度不超过45的熔融的胰酪蛋白大豆蛋白琼脂或糖精琼脂培养基1520ml，混合使用直径大的平皿时，培养基的用量必须相应培养。 在表1所规定条件下进行培养计数。 该法测定供试品对照组及菌液对照组菌数。 计算各试验组的平均菌落数。6.2.6.1.2涂布法采取溶解于温度不超过45的胰酪蛋白琼脂或糖精琼脂培养基1520ml，注入直径90mm的无菌平盘中，凝固成平板，用适当的方法使培养基表面干燥。 使用直径大的平皿，培养基的用量也要相应地增加。 在各平板表面接种0.1ml以上通过上述供试液的调制、接种和稀释和抗菌活性的除去或灭活调制的供试液. 在表1所规定条件下进行培养计数。 该法测定供试品对照组及菌液对照组菌数。 计算各试验组的平均菌落数。6.2.6.2薄膜过滤法中采用的过滤膜孔径为0.45m以下，直径一般为50mm，采用其它直径的过滤膜时，洗涤量应相应调整。 供试品及其溶剂不影响过滤器材质被微生物俘获。 过滤器和过滤器使用前必须用适当的方法灭菌。 使用时请保证过滤器在过滤前后的完整性。 过滤水溶性供试液前先过滤少量冲洗液，润湿过滤器。 油类是供试品，过滤器和过滤器在使用前必须充分干燥。 为了发挥过滤膜的最大过滤效率，必须注意试验品溶液和清洗液复盖过滤膜整个表面。 供试液用膜过滤后，需用冲洗液冲洗过滤膜时，一片过滤膜的冲洗量一般为100ml，总冲洗量不得超过1000ml。 确保薄膜上的微生物不受损伤。将以上述“供试液的调制”、“接种和稀释”和“抗菌活性的除去或灭活”调制的供试液的适量(一般相当于1g、1ml或10 cm2的供试品，供试品中含有的菌数多的情况下，供试液可以适当减量)加入适量的稀释液中混合，进行过滤。 用适量的冲洗液冲洗过滤器。好氧菌总数测定过滤菌面粘贴在胰大豆胨琼脂培养基平板上的霉菌和酵母总数，移动过滤菌面粘贴在萨尔维亚琼脂培养基平板上。 在表1所规定条件下进行培养计数。 每株试验菌培养基至少制备一片过滤器。 该法测定供试品对照组及菌液对照组菌数。6.2.6.3 MPN法MPN法的精度和精度不及薄膜过滤法和皿法，仅在供试品的好氧菌总数没有适当的计数方法时使用，本法不适用于霉菌的计数。 使用MPN法时，按照以下顺序进行。取上述“供试液的制备”“接种和稀释”和“除去或灭活抗菌活性”制备的供试液的至少3个连续稀释水平，每个稀释水平取1ml根，分别接种到加有910ml胰酪蛋白大豆蛋白的培养基中，用同样的方法测定菌液对照组的菌数。 必要时，可在培养基中加入表面活性剂、中和剂和灭活剂。接种管在3035培养3天，每天观察各管微生物的生长状况。 因供试品的原因难以判断结果时，将该管培养物移植到胰大豆蛋白胨液体培养基或胰大豆蛋白胨琼脂培养基中，在相同条件下培养12天，观察微生物有无生长。 根据微生物生长的管子的数量，从表2调查每1g或1ml供试品的好氧菌总数的可能数量。表2可微生物数量检索表生长管数好氧菌总数的最大可能数信赖限度每根管包含样品的g或ml数量MPN/g或ml下限值上限0.10.010.001000309.400130.19.501030.1100116.11.2170206.21.2170309.43.5351003.60.2171017.21.217102114351107.41.320111114351201143512115538130165382009.21.5352011443520220538210154382112053821227994220215402212899422235994230299942313699430023594301389104302641618131043918131175171993121203036031316030380320931836032115030380322210304003232909099033024040990331460901980332110020040003331100 )。注意：如果表中所述的检测量被改变为1g (或ml )并且被改变为0.1g (或ml )和0.01g (或ml )，则表中的数字应当相应地减少10倍以上，而不是0.01g (或ml )、0.001 g (或ml )和0.0001 g (或ml )6.2.7判定结果计数方法适用性的试验中，采用平皿法或薄膜过滤法时，试验组菌落数减去试验品组菌落数后的值与菌液组菌落数之比在0.52范围内的MPN法时，试验组菌落数必须在菌液对照组菌落数的95%以内如果各试验菌回收试验符合要求，按照所用供试液的制备方法和计数方法，计算该供试品的好氧菌总数、霉菌和酵母菌总数。方法适用性确认时，如上述方法不要求回收一株或多株试验菌，选择最接近要求的方法和试验条件进行试验品检验。6.3控制细菌检验方法的验证6.3.1验证用菌株大肠杆菌CMCC