色谱法的原理以及定量分析

第七章色谱法,Chromatography,第七章色谱法,7.1色谱分析法简介7.2色谱图及色谱常用术语7.3色谱法的基本理论7.4色谱定性和定量分析7.5气相色谱法7.6高效液相色谱法,7.1.1色谱法的产生和发展7.1.2什么是色谱法7.1.3色谱法分类,7.1色谱分析法简介,1.色谱法的产生色谱法是一种分离技术俄国植物学家茨维特1906年创立,7.1.1色谱法的产生和发展,分离植物叶子中的色素时，将叶片的石油醚（饱和烃混合物）提取液倒入玻璃管中，柱中填充CaCO3粉末（有吸附能力)，用纯石油醚洗脱（淋洗）。色素受两种作用力影响一种是CaCO3吸附，使色素在柱中停滞下来一种是被石油醚溶解，使色素向下移动各种色素结构不同，受两种作用力大小不同，经一段时间洗脱后，色素在柱子上分开，形成了各种颜色的谱带，这种分离方法称为色谱法。,Tsweet的实验,2.色谱法的发展1930年代初：R.Kuhn把M.Tswett的方法用于类胡萝卜素的分离，从此色谱法得以广泛应用。1935年：Adams和Holmes第一次用苯酚和甲醛合成了人工有机离子交换剂，能交换阳离子和有机氢离子。后来又合成了阴离子交换剂，既可用于离子交换，又用于色谱分离即现时流行的离子交换色谱法。至1950年此方法已成型。,7.1.1色谱法的产生和发展,1938年：Izmailov等人将糊状Al2O3浆液在玻璃板上铺成均匀薄层，用于分离植物中的药用成分，即今日用的薄层色谱。（用于薄层的材料已发展至多种：如硅酸、聚酰胺等）。1941年：Martin和Synge设计了两套萃取仪器，将蛋白质水解产物的乙酰化氨基酸由水溶液中提取到有机相而进行色谱分离。不久又研究了颗粒硅胶柱中三种衍生化氨基酸混合物在水相和有机相(氯仿)之间的不等分配，获得成功，使三个组分得到良好的分离,为液液分配色谱奠定了基础。,1944年：Consden，Gordon和Martin将纤维（滤纸）作固定载体，以水吸附在滤纸上作溶剂，根据组分在两相中溶解度不同，即渗透率（速率）不同而使各组分彼此分离，称之为纸色谱法。1952年：Martin和Synge又研究成功了在惰性载体表面涂渍一层均匀的有机化合物膜作为固定相，并以气体为流动相，用来分离脂肪酸混合物即今日的气液色谱。1954年：Ray提出以热导池作为气相色谱的检测器，使气相色谱应用更加广泛。,1957年：Golay首先应用小口径毛细管柱进行色谱分离实验，结果证明了它具有高分辨率和高效能即为今日的高效气相色谱法。1959年：Porath和Flodin提出了使用具有化学惰性的多孔凝胶作固定相的空间排阻色谱法，根据固定相孔隙尺寸不同而具有不同的选择性渗透能力，从而对分子量分布不同的样品实现了分离。可用于测定聚合物的相对分子质量的的分布。,我国情况我国在色谱分析领域的研究起于1954年中国科学院大连化学物理研究所首先开发经过几十年的努力，我国色谱基础理论研究和应用技术研究方面具有特色，居世界领先行列。,随着被分离样品种类的增多，该方法广泛地用于无色物质的分离，“色谱”名称中的“色”失去了原有的意义，但“色谱”这一名称沿用至今。,1.色谱法混合物在流动相的携带下通过色谱柱分离出几种组分的方法。,7.1.2什么是色谱法,2.色谱法中共使用两相固定相固定不动的相（如：CaCO3）固体吸附剂：CaCO3、Al2O3等液体固定相（载体+固定液高沸点有机化合物，涂在载体上）流动相推动混合物流动的相（如：石油醚）气体1952年产生GC，是色谱法一项革命性进展液体流的速度慢，加压，使其流快，1969年HPLC,7.1.2什么是色谱法,3.色谱分离法特征一定是先分离、后分析一定具有两相：固定相和流动相分离：利用组分在两相中分配系数或吸附能力的差异进行分离,7.1.2什么是色谱法,4.色谱法特点：（1）分离效能高（2）灵敏度高（3）分析速度快（4）应用范围广,7.1.2什么是色谱法,1、按两相状态分类2、按操作形式分类3、按分离原理分类,7.1.3色谱法分类,1、按两相状态分类气相色谱气体作流动相（1）气固色谱：气体作流动相，固体吸附剂作固定相（2）气液色谱：气体作流动相，固定液作固定相。液相色谱液体作流动相（1）液固色谱：液体作流动相，固体吸附剂作固体相（2）液液色谱：液体作流动相，固定液作固定相。超临界液体色谱超临界流体作色谱流动相。,7.1.3色谱法分类,2、按操作形式分类（1）柱色谱：填充柱色谱固定相填充到柱管内毛细管柱色谱把固定相涂在毛细管内壁上，中间是空的。（2）纸色谱：滤纸为固定相的色谱法，流动相是含一定比例水的有机溶剂，样品在滤纸上展开进行分离。（3）薄层色谱：把固体固定相压成或涂成薄膜的色谱法。,7.1.3色谱法分类,3、按分离原理分类（1）吸附色谱：利用吸附剂表面对被分离的各组分吸附能力不同进行分离。（2）分配色谱：利用不同组分在两相分配系数或溶解度不同进行分离。（3）离子交换色谱：利用不同组分对离子交换剂亲和力不同进行分离。（4）凝胶色谱：利用凝胶对分子的大小和形状不同的组分所产生的阻碍作用不同而进行分离的色谱法。,7.1.3色谱法分类,第七章色谱法,7.1色谱分析法简介7.2色谱图及色谱常用术语7.3色谱法的基本理论7.4色谱定性和定量分析7.5气相色谱法7.6高效液相色谱法,7.2.1色谱图7.2.2色谱常用术语7.2.3根据色谱图可得到的重要信息,7.2色谱图及色谱常用术语,7.2.1色谱图,混合物样品（A+B）色谱柱中分离检测器记录下来。组分从色谱柱流出时，各个组分在检测器上所产生的信号随时间变化，所形成的曲线叫色谱图。记录了各个组分流出色谱柱的情况，又叫色谱流出曲线,1.基线在实验操作条件下，色谱柱后没有组分流出的曲线叫基线。稳定情况下是一条直线基线上下波动称为噪音,7.2.1色谱常用术语,2.色谱峰的高度（峰高，h）色谱峰最高点与基线之间的距离可用mm、mV、mA表示峰高低与组分浓度有关，峰越高越窄越好,3.色谱峰的宽度(区域宽度)标准偏差峰高0.607倍处的色谱峰宽的一半。峰底宽Wb色谱峰两侧拐点所作切线在基线上的距离Wb=4半峰宽W1/2峰高一半处色谱峰的宽度W1/2=2.354Wb=4W1/2=0.589Wb,4.色谱峰面积（A）色谱峰与峰底所围的面积。对于对称的色谱峰A=1.065hW1/2对于非对称的色谱峰A=1.065h(W0.15+W0.85)/2,5.死时间t0不被固定相吸附或溶解的组分流经色谱柱所需时间从进样开始到柱后出现峰最大值所需时间气相色谱惰性气体（空气、甲烷等）流出色谱柱所需时间,6.保留时间tR组分流经色谱柱时所需时间。进样开始到柱后出现最大值时所需的时间操作条件不变时，一种组分有一个tR定值定性参数,7.调整保留时间tR扣除了死时间的保留时间，又称校正保留时间，实际保留时间。tR=tR-t0体现的是组分在柱中被吸附或溶解的时间。,8.死体积V0不被固定相滞留的组分流经色谱柱所消耗的流动相体积称死体积，色谱柱中载气所占的体积。V0=t0F0F0-柱后出口处流动相的体积流速mL/min9.保留体积VR组分从进样开始到色谱柱后出现最大值时所需流动相体积，组分通过色谱柱时所需流动相体积VR=tRF010.调整保留体积VR扣除了死体积的保留体积，真实的将待测组分从固定相中携带出柱子所需的流动相体积。VR=tRF0,11.相对保留值i,s在相同操作条件下，组分i对参比组分s调整保留值之比,色谱保留值定性的依据,6.保留时间tR7.调整保留时间tR9.保留体积VR10.调整保留体积VR11.相对保留值i,s组分在色谱柱中停留的数值，可用时间t和所消耗流动相的体积来表示。组分在固定相中溶解性能越好，或固定相的吸附性越强，在柱中滞留的时间越长，消耗的流动相体积越大固定相、流动相固定，条件一定时，组分的保留值是个定值。V0、t0与被测组分无关，因而VR.tR更合理地反映了物质在柱中的保留情况。,7.2.3根据色谱图可得到的重要信息,（1）色谱峰个数判断样品中所含组分的最少个数（2）色谱峰的位置即保留值进行定性分析（3）色谱峰的h、A进行定量分析（4）色谱峰的位置及峰的宽度可评价色谱柱效（分离效能）（5）色谱峰两峰间的距离可评价固定相或流动相选择是否合适,第七章色谱法,7.1色谱分析法简介7.2色谱图及色谱常用术语7.3色谱法的基本理论7.4色谱定性和定量分析7.5气相色谱法7.6高效液相色谱法,色谱分析目的是将样品中各组分彼此分离对样品中的组分进行定性、定量分析组分达到完全分离，两峰间的距离须足够远两峰间的距离是由组分由在两相间的分配系数K决定，即与色谱过程的热力学性质有关。两峰间虽有一定距离，但若每个峰都很宽，彼此重叠，则峰不能分开峰的宽或窄是由组分在色谱住中传质和扩散行为决定，即与色谱过程的动力学性质有关,7.3色谱法的基本理论,7.3.1分配系数和分配比7.3.2塔板理论7.3.3速率理论范第姆特方程7.3.4分离度7.3.5基本分离方程,7.3色谱法的基本理论,在一定温度下，组分在流动相和固定相之间所达到的平衡叫分配平衡，组分在两相中的分配行为常采用分配系数K和分配比k来表示。,7.3.1分配系数和分配比,K仅与两个变量相关：固定相、温度TK与两相体积、管柱特性、使用仪器无关,1.分配系数K(浓度分配系数),7.3.1分配系数和分配比,Cs和cm-组分在固定相和流动相中的浓度,2.分配比k(容量因子，容量比),组分在固定相中的质量组分在流动相中的质量=KVs/Vm,k=ms/mm,k随T、固定相、流动相的体积变化而变化k越大，组分在固定相中质量越多，tR越长K、k越大，组分在固定相中tR就越长,7.3.1分配系数和分配比,ms和mm-组分在固定相和流动相中的质量Vs和Vm-柱中固定相和流动相中的体积,3.k与tR之间的关系,k=tR/t0=(tR-t0)/t0k=VR/V0=(VR-V0)/V0,7.3.1分配系数和分配比,4.K及k与选择因子之间的关系,7.3.1分配系数和分配比,实际意义：=1K（B）=K（A）,tR(B)=tR(A)A、B两组分色谱峰重合K或k相差越大，分离越好，色谱分离先决条件：两组分具有不同的K或k1（1或1）,在50年代，色谱技术发展的初期，Martin等人把色谱分离过程比作分馏过程，并把分馏中的半经验理论塔板理论用于色谱分析法用精馏塔中塔板的概念来描述组分在两相间的分配行为入埋论塔板数作为衡量柱效率的指标,7.3.2塔板理论,塔板理论把色谱柱比作一个分馏塔，假设柱内有n个塔板，每个塔板高度称为理论塔板高度，用H表示，在每个塔板内，试样各组分在两相中分配并达到平衡，最后，挥发度大的组分和挥发度小的组分彼此分离，挥发度大的最先从塔顶（即柱后）逸出。尽管这个理论并不完全符合色谱柱的分离过程，色谱分离和一般的分馏塔分离有着重大的差别，但是因为这个比喻形象简明，因此几十年来一直沿用。,1.基本假设,7.3.2塔板理论,n=L/H或H=L/nL-色谱柱长度H-塔板高度n-塔板数目L固定，H越小，n越多，分离效果越好，H、n评价柱效n与Wb，W1/2的关系n=5.54(tR/W1/2)2=16(tR/Wb)2,2.塔板理论方程式,7.3.2塔板理论,有时计算的n大且H小，但分离效果却不好原因：tR内含t0后来改用有效塔板数和有效塔板高度,n有效=5.54(tR/W1/2)2=16(tR/Wb)2H有效n有效,n理=5.54(tR/W1/2)2=16(tR/Wb)2H理n理,塔板理论的优势用热力学观点形象地描述了溶质在色谱柱中的分配平衡和分离过程，导出流出曲线的数学模型，并成功解释了流出曲线的形状及浓度极大值的位置提出了计算理论塔板高度、塔板数的公式及评价柱效的方法，具有开创性塔板理论的缺点基本假设不完全符合柱内实际发生的分离过程，未考虑各种动力学因素对色谱柱内传质过程的影响同一试样进入同一色谱柱，当流动相速度变化时，得到不同的色谱图；测得的n和H也不同。,1956年，荷兰学者范第姆特(VanDeomter)提出色谱柱分离过程中复杂因素使色谱峰变宽而致柱效降低（H增大）的影响进行描述方程:,u为流动相线速度cm.s-1，线速度=L(柱长)/t0,1.理论模型-范第姆特方程,7.3.3速率理论,提出了影响的三项因素涡流扩散项A,分子扩散项B/u,传质阻力项Cu流动相流速一定，当、最小时，才小，n最高，柱效高当、最大时，才大，n最小，柱效低,（1）涡流扩散项A,在填充色谱柱中，当组分随流动相向柱出口迁移时，流动相由于受到固定相颗粒障碍，不断改变流动方向，使组分分子在前进中形成紊乱的类似“涡流”的流动，故称涡流扩散。,涡流扩散项系数AA2dp-填充不规则因子dp-填充物的平均直径减小：固定相颗粒应适当细小、要均匀填充,待测组分是以“塞子”的形式被流动相带入色谱柱的，在“塞子”前后存在浓度梯度，由浓稀方向扩散，产生了纵向扩散，使色谱峰展宽。,（2）分子扩散项B/u（纵向扩散项）,分子扩散项系数BB2D是填充柱内流动相扩散路径弯曲的因素，也称弯曲因子，它反映了固定相的几何形状对分子扩散的阻碍情况。D为组分在流动相中扩散系数（cm2s-1）。Dg气相扩散系数比液相扩散系数Dm大的多（约105倍）减小纵向扩散项u采取措施：适当提高流动相流速u，减小保留时间用相对分子质量较大的气体作流动相Dg适当降低柱温,（3）传质阻力项Cu,传质阻力系数Cm+Cs,m,Cs固定项传质阻力系数,即组分从两相界面移动到固定相内部，达分配平衡后，又返回到两相界面，在这过程中所受到的阻力为固定相传质阻力。,2,Cm流动相传质阻力系数,组分从流动相移动到固定相表面进行两相之间的质量交换时所受到的阻力，质量交换慢，引起色谱峰变宽。,减小的措施：采用粒度小的填充物Cmdp2相对分子质量小的载气，Dg大Cm1/Dg降低固定液液膜厚度并且液膜要均匀；膜太厚，扩散费时；腊太薄，包不住载体。Csdf2Ds越大越好，增加柱温是提高Ds的方法之一,Cm+Cs,m,2,为提高柱效，小，应注意以下几点：采用适当小而均匀的载体，柱填充应均匀。固定液液膜薄而均匀，并且不宜流失。载气流速流速小时，u是影响的主要因素，选r大的载气，；流速大时，Cu是影响的主要因素，选r小的载气，H2，Ne采用适当的柱温。,气相色谱,液相色谱,GC（a）u有一最低点u最佳；u小或u大，H都大LC（b）u没有最低点；u大，H增大不多，因此可用较高的流速，提高分析速度,（4）流动相线速度u对H的影响,可测三种流速对应的板高H，解三元一次方程，求出A、B、C即可求出u最佳和H最小。实际工作中，为缩小分析时间，可选略高u最佳的流速，常用u最佳。,GC中最佳流速可通过实验和计算方法求得,7.3.4分离度R,定义：相邻两个峰的保留值之差与两峰宽度平均值之比色谱柱的总分离效能指标,分子反映溶质在两相中分配行为对分离的影响，是色谱分离的热力学因素。分母反映动态过程溶质区带的扩宽对分离的影响，是色谱分离的动力学因素。两溶质保留时间相差越大，色谱峰越窄，分离越好,两个峰tR相差越大，W越窄，值越大，说明柱分离较能高。.5两个组分能完全分开。.0两组分能分开，满足分析要求。.0两峰有部分重叠。,1.分离度与柱效能，选择性的关系,柱效能指色谱柱在分离过程中的分离效能，常用n，来描述，n越大，越小，柱效越高，对单个组分而言。对多个组分的分离来说，无法用n,H来描述，n大，小，几个峰未必分的开。,选择性描述两个相邻组分在同一固定相中热力学分布行为的重要参数，用r2,1相对保留值表示.r2,1越大，保留时间相差大，分离越好（但未考虑峰宽因素）,7.3.5色谱基本分离方程,、分离度与柱效能，选择性的关系,n=5.54(tR/W1/2)2=16(tR/Wb)2,、分离度与柱效能，选择性的关系,a:柱效项：塔板数决定，n越大，柱效越高分离的越好。,、分离度与柱效能，选择性的关系,b：选择性项：r2,1越大，tR（）与tR（1）相差越大，分的越好。,C：柱容量项：k大一些对分析有利;太大，tR长，柱容量合适,分的才好。一般k,以n有效表示，则有：,例题：,在一定条件下，两个组分的调整保留时间分别为85秒和100秒，要达到完全分离，即R=1.5。计算需要多少块有效塔板。若填充柱的塔板高度为0.1cm，柱长是多少？解：r21=100/85=1.18n有效=16R2r21/(r211)2=161.52(1.18/0.18)2=1547（块）L有效=n有效H有效=15470.1=155cm即柱长为1.55米时，两组分可以得到完全分离。,第七章色谱法,7.1色谱分析法简介7.2色谱图及色谱常用术语7.3色谱法的基本理论7.4色谱定性和定量分析7.5气相色谱法7.6高效液相色谱法,7.4.1定性分析7.4.2定量分析,7.4色谱定性和定量分析,124色谱定性和定量分析,一、定性分析定性分析的任务是确定色谱图上各个峰代表什么物质。1.利用保留值与已知物对照定性（1）利用保留时间定性在相同色谱条件下，将标准物和样品分别进样，两者保留值相同，可能为同一物质。此方法要求操作条件稳定、一致，必须严格控制操作条件，尤其是流速。,（2）利用峰高增量定性,若样品复杂，流出峰距离太近，或操作条件不易控制，可将已知物加到样品中，混合进样，若被测组分峰高增加了，则可能含该已知物。（3）利用双色谱系统定性通过改变色谱条件来改变分离选择性，使不同物质显示不同保留值。例：选用极性差别较大的两种不同固定液来制备色谱柱，不同物质具有不同保留值,2.与其它分析仪器联用的定性方法,小型化的台式色质谱联用仪（GC-MS；LC-MS）色谱-红外光谱仪联用仪；组分的结构鉴定,二、定量分析,气相色谱定量分析是根据检测器对溶质产生的响应信号与溶质的量成正比的原理，通过色谱图上的峰面积或峰高，计算样品中溶质的含量。,mi=fiAimi=fihimi被测组分i的质量，fi比例系数Ai、hi被测组分的峰面积及峰高,A=1.065hW12A=1.065h（W0.15W0.85）/2,1、定量校正因子,色谱定量分析是基于峰面积与组分的量成正比关系。但由于同一检测器对不同物质具有不同的响应值，即不同物质检测器的灵敏度不同，相同的峰面积并不意味着有相等的量。定量校正因子：单位峰面积对应组分的质量。fi=mi/Aifi绝对校正因子,(1)绝对校正因子绝对校正因子受操作条件影响较大，要严格控制色谱条件，不易准确测定，没有统一标准，无法直接引用，定量分析中采用相对较正因子。,（2）相对校正因子,用一个标准，把所有组分的A较正到标准物的A上，在同一标准上进行比较计算，热导检测器常用苯作标准。相对定量校正因子fi定义：样品中各组分的定量校正因子与标准物的定量校正因子之比。,fi(m)表示相对质量校正因子,也可用相对摩尔校正因子fi(M),（2）相对校正因子,凡文献查得的校正因子都是指相对校正因子，可用fM,fm分别表示摩尔校正因子和质量校正因子,2、定量