渤海海泥放线菌非培养多样性研究答辩论文.ppt

渤海海洋沉积物放线菌非培养多样性研究,指导老师：李静老师学生姓名：曹燕兵专业年级：生物科学2008级,内容提要,1、前言,放线菌（Actinomycetes)一类具有分枝状菌丝体的，高GC含量的革兰氏阳性细菌。代谢活动活跃，次级代谢产物丰富多样。,海洋放线菌（marineActinomycetes）海洋放线菌的分布十分广泛海洋特殊环境的选择压力造就了海洋放线菌物种及代谢产物的独特性、多样性，所蕴涵的应用潜力不可估量。,渤海简介,近封闭的内海，地处中国大陆东部的最北端，盐度仅为30PSU近10年来,陆域活动造成的渤海中部海区水质下降和富营养化等环境污染问题正不断引起各方面的高度重视,海区及其周边区域的生态环境正面临着越来越大的压力,渤海北部海域海洋放线菌的研究,在我国，对海洋放线菌的研究已有初步规模。但基本上集中在南方红树林生境、南海以及南北极和部分热泉等特定环境中，而对北部海洋放线菌的研究非常少。已见报道的为青岛近海和大连、烟台沿岸潮间带中可培养放线菌。对渤海这一受人为活动影响较大、环境恶劣的区域，海洋放线菌的群落结构、资源、多样性会有什么样的变化，还很少有研究。,2、材料与方法,材料渤海样品B71-2采集时间:2011.6.2819:39地理位置:12019.620E380.555N水深19.9米沉积物渤海样品B37-3采集时间:2011.6.2414:03地理位置:12113.044E3806.429N水深32米下层40cm沉积物,方法,放线菌宏基因组DNA的提取及纯化,周法,试剂盒法,放线菌特异性引物扩增,A-19、S-20,连接转化、构建克隆文库,RFLP,系统进化树构建,多样性分析,分析测序结果,Mothurr.1.25.0,EstimateSwin820,Mega5.0,3、实验结果与分析,3.1、总DNA的提取及放线菌特异性序列的扩增样品B71-2,B37-3的总DNA琼脂糖凝胶电泳检测结果见图1。B71-2电泳条带比B37-3的条带稍亮，可以看出两个样品中DNA含量都很高,图1：宏基因组DNA电泳检测结果M:-HindIIIMarker；1：B71-22：B37-3,3.2、两个样品的总DNA用放线菌特异性引物（S-20，A-19）进行扩增，在640bp处出现目的条带（见图2）。,图2：放线菌特异性引物扩增DNA电泳检测结果M：MarkerD20001：对照2：B37-33：B71-2,M1,3.3菌落PCR电泳验证结果利用放线菌特殊引物s-20；a-19为引物进行连接转化，对菌液进行PCR的结果（部分样品）如图3：,图3、菌落PCR电泳图像1：MarkerD2000条带：B71-269-78,3.4HaeIII酶切后电泳结果部分样品如图3-3：,图3-3：HaeIII酶切电泳结果1：MarkerD2000条带：B71-239-58,3.5、分析测序结果（B71-2）克隆序列经Mothurr.1.25.0进行OTUs划分，并用核糖体数据库对其分类位置进行划分。经分析：B71-2样品的27个克隆子获得了23个OTUs,其中34.8%的克隆序列分布于放线菌门(phylumActinobacteria)放线菌亚纲(Actinobacteridae)和酸微菌亚纲(Acidimicrobidae)中，并且在这两个亚纲中有62.5%的克隆序列属于放线菌的新分类单元,3.6多样性指数分析（B71-2),运用EstimateSWin820软件，分析B71-2位点的放线菌16srDNA基因文库，文库中96个克隆的稀有度曲线如下图。,渤海沉积物B71-2位点放线菌稀有度曲线,香农指数是反映物种丰富度和物种均匀度的综合性多样性指数；辛普森指数（Simpsonsdiversityindex）是一种简便的测定群落中物种多样性的指数。计算得B71-2位点的shanno指数为3.09，simpson指数为0.0783。覆盖度（CoverageC）为78.26%,3.7系统进化树分析（B71-2）,由进化树可看出参与构建树的25个克隆子中有17个克隆子（占68%）与有效发表的所有类群无较近的亲缘关系，如克隆序列62、69、87，它们以极高的自展值支持形成一个独立的大分支，极有可能代表一个新亚目或更高级分类单元的类群。,3.5、分析测序结果（B37-3）经分析：B37-3样品的31个克隆子获得了24个OTUs，其中37.5%的克隆序列分布于放线菌门(phylumActinobacteria)放线菌亚纲(Actinobacteridae)和酸微菌亚纲(Acidimicrobidae)中，并且在这两个亚纲中有66.7%的克隆序列属于放线菌的新分类单元;,3.6多样性指数分析（B37-3),运用EstimateSWin820软件，分析B37-3位点的放线菌16srDNA基因文库，文库中96个克隆的稀有度曲线如下图。,渤海沉积物B37-3位点放线菌稀有度曲线,shanno指数为3.06。simpson指数为0.0791.覆盖度（CoverageC）为79.16%,3.7、系统进化树分析（B37-3),由进化树可看出参与构建树的25个克隆子中有17个克隆子（占71%）与有效发表的所有类群无较近的亲缘关系，如克隆序列24、74、91，它们以极高的自展值支持形成一个独立的大分支，极有可能代表一个新亚目或更高级分类单元的类群。,4、讨论,1、实验结果表明，渤海沉积物放线菌多样性程度非常高。但本次试验只挑选了96个克隆子，导致覆盖度比较低。想要更深入的了解渤海地区海底沉积物中放线菌多样性，需要适当增加挑取的克隆数，选取更多的克隆子进行测序分析。2、通过对渤海两个位点B71-2、B37-3的研究分析，发现渤海沉积物中蕴含大量未培养的放线菌资源，发现渤海沉积物中含有大量未培养的放线菌新的