植物快速繁殖和脱毒上.ppt

第七章植物快速繁殖和脱毒,第一节植物快速繁殖的途径和方法第二节继代培养第三节快速繁殖中茎尖培养脱毒第四节其他途径脱毒第五节脱毒苗的鉴定第六节脱毒后防病毒再感染,第一节植物快速繁殖的途径和方法,植物离体快速繁殖技术的概念:将来自优良植株的茎尖、腋芽、鳞片、叶片等器官、组织或细胞进行离体培养，以期在短期内以快速获得遗传上稳定一致的大量个体。与传统无性繁殖方式的区别:繁殖速度快，不受自然的干扰，使育苗工厂化。,植物快繁的类型与器官形成方式：1不定芽型2器官型3器官发生型4胚状体发生型5原球茎发生型,比较,1不定芽型,诱导顶端分生组织产生不定芽，再生成植株的方式。方法：选取已经发育成熟的顶芽和腋芽，连同短枝经表面灭菌后，在无菌条件下培养，诱导不定芽并使其生根形成植株的方式。取材：只要有明显的顶端分生组织和次生组织的植物均适用。,原理：不少植物具有大量的腋芽分生组织，但在整体植物上由于顶端优势效应，多数腋芽受到内源激素的制约而抑制生长。若将腋芽从整体植物上分离下来，给以相应的培养条件，即可形成大量不定芽。,腋芽增殖,不定芽发生型的特点：繁殖率高利用外植体原有的芽，包括隐芽在内繁殖数量大，同时能保持该植物种的遗传稳定性。,从器官外植体诱导不定芽，再生成植株的方式。方法：选取充分发育的器官诸如茎、叶、花器、鳞片等，经离体培养而产生植株的方式。,2器官型,器官型特点：遗传性也比较稳定，但繁殖速度慢。,从器官外植体诱导愈伤组织，经愈伤组织细胞的分化再生成植株的方式。,3器官发生型,器官发生型的特点：繁殖速度快，由于经愈伤组织而再生成植株，遗传性不稳定。,由植物器官、组织和细胞培养而直接发生胚状体，最后以胚状体成苗的方式。据不完全资料统计，在被子植物中有胚状体发生的植物已达100余种，分属近40个科。,4胚状体发生型,可可心形胚和球形胚,香蕉心形体细胞胚,玫瑰心形体细胞胚,胚状体发生型的特点：遗传性一致，部分植物体细胞发生数量相当大。,5原球茎型,大部分兰花属于这一类型。原球茎是兰花种子萌发时产生的呈珠粒状、缩短的、类似嫩茎的器官。方法：种子消毒后，在培养基上播种，经一段时间培养而发生原球茎（带芽），然后由原球茎直接长成植株。,原球茎,原球茎发育成兰苗,1）不定芽型：容易成苗，对培养基要求不高，后代遗传性较为稳定，缺点：但取材受到一定限制，仅限于具有明显顶端分生组织和次生分生组织的物种。2）器官型和胚状体发生型：遗传性稳定。缺点：对培养基要求高，器官发生条件苛刻。繁殖数量不如不定芽型和器官发生型多；,五种器官发生方式优点、缺点比较：,3）器官发生型（由愈伤组织再生植株）优点：成苗数量大，对培养基要求不算高，容易调配。缺点：通过愈伤组织成苗，细胞的染色体容易发生数量和结构变异，很难使再生植株群体保持稳定的遗传性。,第七章植物快速繁殖和脱毒,第一节植物快速繁殖的途径和方法第二节继代培养第三节快速繁殖中茎尖培养脱毒第四节其他途径脱毒第五节脱毒苗的鉴定第六节脱毒后防病毒再感染,第二节继代培养,在初代培养的基础上所获得的芽、苗、胚状体和原球茎等，数量都还不够，需要进一步增殖，使之越来越多，从而发挥快速繁殖的优势。继代培养：是继初代培养之后的连续数代的扩繁殖培养过程。继代培养的后代按几何级数增加，如果以2株苗为基础，那么经10代将生成210株苗。,1驯化现象2衰退现象,第二节继代培养,1驯化现象,驯化（acclimation）:在开始继代培养要加入生长调节物质，其后加入少量或不加入生长调节物质就可以生长的现象。如在胡萝卜薄壁组织培养过程中，初代中加入10-6mol/LIAA，才能达到最大生长量，但经多次继代培养后，在不加IAA的培养基上也可达到同样生长量.发生原理：继代培养中细胞积累了较多的生长物质，因此逐渐减少对外源生长物质的需要。,2衰退现象,衰退(recession):长期培养的材料也会逐渐衰退,丧失形态发生能力，表现为生长不良，再生能力和增殖率下降等。不同的植物其保持再生能力的时间是不同的，而且差异很大，在以腋芽或不定芽增殖继代的植物中，在培养许多代之后仍然保持着旺盛的增殖能力，一般较少出现再生能力丧失问题。,2.1分化能力衰退的机理：,1）愈伤组织中含有从外植体启动分裂时就包括进来的成器官中心（分生组织），当重复继代会逐渐减少或丧失，这意味着不能形成维管束，只能保持无组织的细胞团。2）也可能是在继代培养过程中，逐渐消耗了原有的与器官形成有关的特殊物质。3）也可能与内源生长调节物质的减少或丧失有关。4）也可能是细胞染色体出现畸变，数目增加或丢失,（1）植物材料的影响（2）培养基及培养条件（3）继代培养时间长短（4）季节的影响,2.2影响继代培养的因素,2.2影响继代培养的因素,（1）植物材料的影响不同种类植物，同种植物不同品种，同一植物不同器官和不同部位继代繁殖能力也不相同。一般是草本木本；被子植物裸子植物；年幼材料老年材料；刚分离组织已继代的组织；胚营养体组织；芽胚状体愈伤组织。,（2）培养基及培养条件培养基及培养条件影响颇大，故常改变培养基和培养条件来保持继代培养，如在水仙鳞片基部再生子球的继代培养中，加活性炭的培养基中再生子球比不加活性炭的要高出一至几倍。MS培养基初次培养的桃茎尖，若转入同样的MS培养基则生长不良，而转入降低氨态氮和钙，增加硝态氮、镁和磷的培养基中则能继代繁殖。,（3）继代培养时间长短,继代培养次数对繁殖率的影响不一。有的材料长期继代可保持原来的再生能力和增殖率，如葡萄、月季和倒挂金钟等。有的经过一定时间继代培养后才有分化再生能力。沙枣愈伤组织继代培养6次后，才分化苗，保持二年，仍具有分化能力。有的随继代时间加长而分化再生繁殖能力降低，如杜鹃茎尖外植体，连续继代培养，产生小枝数量开始减少。,（4）季节的影响,有些植物材料能否继代与季节有关。如水仙取6、7月份的鳞茎，因夏季休眠，生长变慢，8月休眠后，生长速度又加快。百合鳞片分化能力的高低，表现为春季秋季夏季冬季。打破休眠的方法：球根类植物组织培养可通过加入激素和低温处理来克服。如：MS培养基上得到的唐菖蒲球茎，无机盐和糖浓度减半，增加萘乙酸用量，可以防止继代中的休眠。,盲目追求过高增殖倍数缺点：一是所产生的苗小而弱，给生根、移栽带来很大困难；二是可能会引起遗传性不稳定，造成灾难性后果。,第七章植物快速繁殖和脱毒,第一节植物快速繁殖的途径和方法第二节继代培养第三节快速繁殖中茎尖培养脱毒第四节其他途径脱毒第五节脱毒苗的鉴定第六节脱毒后防病毒再感染,全世界已发现植物病毒有近700种，植物病毒病严重地影响果树、蔬菜、花卉、林木等植物的生长，造成产量降低，品质变劣，其危害仅次于真菌病害。受病毒浸染的植物终身带毒，目前尚无药物可以治愈。,由病毒引起作物产量和品质退化的事例甚多。粮食作物：最典型的是马铃薯退化，叶片卷缩或叶花白，产量一年不如一年。果树：香蕉束顶病、柑桔黄龙病、苹果花叶病毒等多种病毒病。蔬菜：有白菜病毒病、番茄病毒病等。花卉：有国兰花叶病、香石竹驳斑病、菊花斑萎病等。,香蕉束顶病（俗称蕉公），,郑州果树研究所草莓脱毒苗,第三节快速繁殖中茎尖培养脱毒,1病毒在植物体内的分布2无病毒苗的获得,1病毒在植物体内的分布,病毒侵染到感染植株的叶片后，经过一段时间，即向附近细胞增殖转移。转移速度很慢，每小时只有几微米。当叶片内病毒数量到一定程度时，就转移到韧皮部，随后通过维管束转移到其他部分。,为什么茎尖培养能够除去病毒？,病毒运转速度慢，加上茎尖分生组织没有维管束，病毒只能通过胞间连丝传递，赶不上细胞分裂和生长的速度，所以茎尖生长点的病毒数量极少或无，几乎检测不出。进行茎尖培养时，切取茎尖越小，带有病毒的可能性就越小，但太小不易成活。不同种类的植物和不同病毒而言，切取茎尖的大小也不相同（表7-1）。,普通茎尖几毫米到几十毫米的芽尖及侧芽。,微茎尖为0.3-0.5mm,表7-1离体茎尖长度对马铃薯脱除病毒的影响,表7-2带病毒植物脱除病毒时宜采用的茎尖大小,茎尖培养除可除去病毒外，还可除去其他病原体，如细菌、真菌等。无病毒苗只是相对而言：因为茎尖还有已知及未知的其他病毒，除去的病毒是指主要危害的几种病毒，严格来说，是“无特定病毒的苗”。,脱毒后的马铃薯苗,第三节快速繁殖中茎尖培养脱毒,1病毒在植物体内的分布2无病毒苗的获得2.1材料的培养和灭菌2.2茎尖剥离2.3茎尖培养2.4提高脱毒效果,茎尖培养途径：茎尖丛生芽生根再生株（无毒）（无毒）,2无病毒苗的获得,茎尖取材：,2.1材料的培养和灭菌供试植株要种在无菌土中，温室种植。也可去插条在室内溶液培养。定期喷施杀菌剂（如链霉素）也有效。,2.2茎尖剥离,取幼苗茎尖23cm小段，剥去可见的大叶，自来水冲洗1h左右后进入无菌室。先用95%酒精快速浸泡一下，再放入5%漂白粉消毒710min（或5%次氯酸钠溶液），然后无菌水冲洗34次，在双筒解剖下剥去幼叶，露出圆滑的生长点，用解剖针切取带12个叶原基的生长点，接种到培养基上进行培养。这种外植体（生长锥带12个原叶基）的培养，严格来说，应称为分生组织培养。,取2-3顶梢,第三节快速繁殖中茎尖培养脱毒,1病毒在植物体内的分布2无病毒苗的获得2.1材料的培养和灭菌2.2茎尖剥离2.3茎尖培养2.4提高脱毒效果,2.3茎尖培养,常用MS和White培养基，较高浓度的无机盐，对促进组织分化和愈伤组织生长是有利的。可添加5%10%椰乳，0.11.0mg/L的吲哚乙酸、萘乙酸、苄基腺嘌呤等，有的还需添加活性炭。根据培养种类不同，添加的生长调节剂可适当调整。,图7-1葡萄茎尖脱毒培养过程示意图葡萄茎尖脱毒经过7个时期：A接种后变绿增大期；B形成畸形叶期；C形成多芽和芽伸长期；D多芽展开小叶和小叶伸长期；E发根期；F根和茎伸长期；G移栽入盆期,第三节快速繁殖中茎尖培养脱毒,1病毒在植物体内的分布2无病毒苗的获得2.1材料的培养和灭菌2.2茎尖剥离2.3茎尖培养2.4提高脱毒效果2.4.1高温处理2.4.2低温处理2.4.3化学处理,2.4提高脱毒效果,2.4.1高温处理又称温热疗法某些病毒受热以后不稳定，失去活性。把植物放在高于正常温度的环境中，组织内部的病毒受热后部分或全部钝化，但寄生植物的组织很少或不会受到伤害。,热处理时间因植物而异,（1）温汤浸渍处理50左右的温水中浸渍材料数分钟至数小时，方法简便易行但易致材料受伤。（2）热风处理将植物移入室内或生长箱内，处理温度和时间因植物种类和器官生理状况而异。一般为3540，短则几十分钟，长可达数月。例如康乃馨置于38两个月，草莓366周，即可清除茎尖的病毒。如马铃薯未脱毒小苗在生长箱中变温处理，354h，314h，交替1个月，其脱毒效果可达80%以上。,变温处理的优点：35使病毒钝化，31可提高小苗生活力，这样既提高脱毒率，又能提高成苗率。热处理的局限性（1）并非所有的病毒都对热处理敏感。热处理只对等径、线状的病毒和类菌质体起作用。（2）延长热处理时间，病毒钝化效果好，同时也可能会钝化植物组织中的抗性因子而降低处理效果。（3）热处理后只有一小部分植株能够存活。,第三节快速繁殖中茎尖培养脱毒,1病毒在植物体内的分布2无病毒苗的获得2.1材料的培养和灭菌2.2茎尖剥离2.3茎尖培养2.4提高脱毒效果2.4.1高温处理2.4.2低温处理2.4.3化学处理,2.4.2低温处理，亦称冷疗法。,菊花植株在5条件下分别处理4个月或7.5个月，没有菊花矮化病毒（CSV）的无病毒苗分别是67%和73%，没有菊花褪绿斑驳病毒（CCMV）的无病毒苗分别是22%和49%，未经处理的茎尖则无脱毒效果。,2.4.3化学处理，又称化学疗法。,一些化学药品如嘌呤和嘧啶类似物、氨基酸、抗生素处理，可在某种程度上抑制植物体内或离体叶片内病毒的合成，但仍不能使病毒失活。三氮唑核苷用于防治一系列动物DNA和RNA病毒，对植物也有效。,表7-4烟草外植体在三氮唑核苷条件下培养脱毒情况,第七章植物快速繁殖和脱毒,第一节植物快速繁殖的途径和方法第二节继代培养第三节快速繁殖中茎尖培养脱毒第四节其他途径脱毒第五节脱毒苗的鉴定第六节脱毒后防病毒再感染,第四节其他途径脱毒,1愈伤组织脱毒2珠心胚培养脱毒3茎尖微体嫁接脱毒4培育抗病毒栽培种,1愈伤组织脱毒感染病毒的愈伤组织细胞并非全部含有病毒。原因：可能因为细胞增殖速度快过病毒复制速度，或者细胞产生变异，获得对病毒感染的抗性，最终表现出脱毒现象。缺陷：后代变异的几率大；有的愈伤组织不能分化成苗。,2珠心胚培养脱毒,柑橘类多胚品种中除一个受精胚以外，尚有多个由珠心细胞形成的无性胚，称为珠心胚。珠心胚与维管束系统无联系，因此由珠心胚产生的植株全部均无病毒。珠心胚大多是不育的，必须分离培养才能发育成正常的幼苗。珠心胚培养技术对除去柑橘主要病毒，如引起银屑病、叶脉突出病、柑橘裂皮病、柑橘速度病等的病毒，都十分有效。,3茎尖微体嫁接脱毒,木本植物茎尖培养难以生根形成植株。将实生苗砧木培育在培养基上，再从成年无病毒树枝上切取茎尖（0.141.0mm），在砧木切断面上进行试管微体嫁接，就可获得无病毒的幼苗。,4培育抗病毒栽培种,烟草和黄花烟草的杂交种具有TMV抗性马铃薯栽培种和野生种的杂种后代可抗PVY。,第七章植物快速繁殖和脱毒,第一节植物快速繁殖的途径和方法第二节继代培养第三节快速繁殖中茎尖培养脱毒第四节其他途径脱毒第五节脱毒苗的鉴定第六节脱毒后防病毒再感染,第五节脱毒苗的鉴定,鉴定原因：利用生长点培养无毒苗的成苗率和脱毒率非常低，有时无毒株只占千分之几。许多病毒具有延迟的恢复期，所以在最初18个月中每隔一定时间仍需进行鉴定。无病毒植株容易再被感染，因此在繁殖的不同时期仍需重复进行鉴定。,鉴定方法,1直接测定法2指示植物法3抗血清鉴定法4电子显微镜检查法,1直接测定法,直接观察植株茎叶有无某种病毒引起的可见症状。缺点：寄主植物感染病毒后需要较长的时间才出现症状，有的并不能使寄主植物出现可见症状，因此需要更敏感的测定方法。,2指示植物法,利用病毒在其他植物上出现症状的特征，作为鉴别种类的标准。这种专用以产生症状的寄主即为指示植物，又称鉴定寄主。方法：接种时取待测植物的幼叶，加少量水及等量0.1mol/L磷酸缓冲液（pH7.0），磨成匀浆，吸取少量浆液揩抹在指示植物叶片上涂有500600目金刚砂，轻轻磨擦使浆液能侵入叶片表皮细胞但又不损伤叶片。5分钟后用水冲洗叶面。将被接种的指示植物置于有防蚜虫网罩的温室内，1525，数天至几周后，指示植物即出现可见的症状。,表7-5几种马铃薯病毒种类的症状,利用嫁接法接种：把待测的植物接种在敏感植物上，然后视其有无病斑，来判断是否脱除了病毒。,指示植物,接穗,嫁接后的植物,3抗血清鉴定法,植物病毒是由核酸和蛋白质组成的核蛋白复合体，也是一种抗原，注射到动物体内即产生抗体，抗体存在于血清之中，称为抗血清。由于不同病毒产生的抗血清都有特异性，用特定病毒的抗血清来鉴定该种病毒，具有高度专一性和特异性，几分钟至几小时即可完成，方法简便，所以成为植物病毒鉴定中最有用的方法之一。,4电子显微镜检查法,直接观察到病毒微粒是否存在，病毒颗粒的大小、形态和结构。方法：投影法、背景染色法、表面复形的制备与扫描电镜法，以及超薄切片法。,第七章植物快速繁殖和脱毒,第一节植物快速繁殖的途径和方法第二节继代培养第三节快速繁殖中茎尖培养脱毒第四节其他途径脱毒第五节脱毒苗的鉴定第六节脱毒后防病毒再感染,第六节脱毒后防病毒再感染,1无病毒苗的隔离保存2无病毒苗的长期保存,1无病毒苗的隔离保存,1.1昆虫传染病毒无病毒苗种植在隔离网室中，防止蚜虫或其他昆虫