广西地方标准《水稻品种抗南方水稻黑条矮缩病人工接种鉴定技术规范》（征求意见稿）

ICS6502020B16DB45广西壮族自治区地方标准DB45/TXXXXXXXXX水稻品种抗南方水稻黑条矮缩病人工接种鉴定技术规范TECHNICALSPECIFICATIONFOREVALUATINGRICEVARIETIESRESISTANCETOSOUTHERNRICEBLACKSTREAKEDDWARFVIRUSDISEASEBYINOCULATION点击此处添加与国际标准一致性程度的标识（征求意见稿）（本稿完成日期）XXXXXXXX发布XXXXXXXX实施广西壮族自治区质量技术监督局发布DBXX/XXXXXXXXXI前言本标准按照GB/T112009给出的规则起草。本标准由广西壮族自治区农业科学院提出。本标准起草单位广西壮族自治区农业科学院植物保护研究所、广西作物病虫害生物学重点实验室、江苏省农业科学院植物保护研究所。本标准主要起草人秦碧霞、李战彪、谢慧婷、周彤、黄所生、崔丽贤、李丹婷、蔡健和、夏秀忠、兰莹。DBXX/XXXXXXXXX1水稻品种抗南方水稻黑条矮缩病人工接种鉴定技术规范1范围本标准规定了水稻品种抗南方水稻黑条矮缩病（病原南方水稻黑条矮缩病毒（SOUTHERNRICEBLACKSTREAKEDDWARFVIRUS，SRBSDV）人工接种鉴定的技术规范及抗性评价标准。本标准适用于水稻品种材料抗南方水稻黑条矮缩病性状的鉴定与评价。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。NY/T26312014南方水稻黑条矮缩病测报技术规范3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。31病株INFECTEDPLANTS指表现南方水稻黑条矮缩病毒病症状的水稻植株（病害鉴定调查标准见48）32发病率RATEOFINFECTEDPLANTS指病株占调查水稻总植株数的百分率。33无毒白背飞虱VIRUSFREEWHITEBACKEDPLANTHOPPER本标准中特指不携带南方水稻黑条矮缩病毒的白背飞虱（SOGATELLAFURCIFERAHORVTH）。4人工接种鉴定41接种用白背飞虱的准备411白背飞虱的采集DBXX/XXXXXXXXX2白背飞虱若虫或成虫采集自田间。412饲养白背飞虱的基本设备可调控温光的养虫室（温度保持于（261）范围内，相对湿度8090，光照每天12H）；1000ML玻璃或透明塑料杯、尼龙纱布（网眼规格1MM）、养虫架、适宜白背飞虱繁殖的水稻种子（宜采用白背飞虱喜食性品种如特优63等）；转移白背飞虱用黑布、试管、吸虫管等。413无毒白背飞虱群体的获得选取饲喂白背飞虱的水稻种子用水浸种24H后，纱布覆盖，恒温箱（322）催芽（24H48H），选取发芽良好的种子（25粒30粒）均匀播于盛有自然肥力土壤的塑料杯中内径80MM110MM；大约6D7D后，待苗长至15叶期时，将待产的单头白背飞虱移入杯中产卵，约3D后将成虫移出，单独保存，7D10D后孵化出若虫。按NY/T26312014，附录C的规定对产卵的白背飞虱进行检测，筛选其中无毒白背飞虱的后代进行繁殖，每批随机取出30头50头白背飞虱进行带毒率检测，带毒率始终为0，则该批白背飞虱为无毒白背飞虱群体。42病株准备421病株采集到重病区采集表现南方水稻黑条矮缩病疑似症状的水稻植株种植在防虫网笼中的塑料桶中。422病株检测确定采病株叶片按NY/T26312014，附录C的规定或参考附录A进行检测，确认感染南方水稻黑条矮缩病毒则作为毒源保存，并经白背飞虱接种扩繁病株。43饲毒方法将42的病株种于大烧杯内径100MM200MM中,土面覆盖滤纸,将适量1龄2龄无毒白背飞虱移入其中,并用60目防虫网封口。饲毒2D后将虫移入塑料杯内径80MM110MM,预先育有白背飞虱喜食品种如特优63的秧苗中饲养,11D后，每批随机取出30头白背飞虱高龄若虫或成虫，按NY/T26312014，附录C的规定检测白背飞虱群体带毒情况，计算白背飞虱群体的带毒率。44育苗方法441催芽参鉴品种（含感病对照）经413方法浸种、催芽；选取30粒左右发芽良好的种子均匀播于盛有自然肥力土壤的塑料杯内径80MM110MM中。442重复按441育苗方法每品种重复3次。45接种苗龄（152）叶龄期。46接种方法选取43已饲毒且度过循回期的白背飞虱成虫接种群体，计算接虫数量，DBXX/XXXXXXXXX3人工接种鉴定的有效接种虫量用IVS表示，数值以头/苗计，按公式1计算IVSNPVS（1）式中IVS人工接种鉴定的有效接种虫量；N接种白背飞虱数量；PVS白背飞虱带毒率。当IVS值处于1头/株2头/株范围内，方可认为试验有效。从接种群体中随机抽取50头以上虫，测定带毒率，计算接虫数量后接入已育有参鉴品种的塑料杯内径80MM110MM中，接种时间为2D，接种温度（261），且每天上午和下午各赶虫一次，使白背飞虱分布均匀，2D后用杀虫剂将接种用白背飞虱全部扑杀，将秧苗移出塑料杯，至1530条件下培育，常规管理，定期观察植株发病情况。47调查时间接种20D后进行调查；共调查3次，每次调查间隔期不少于7D，第一次调查时同时确定有效鉴定株数。48调查标准SRBSDV苗期发病症状秧苗叶色浓绿，叶片短小僵直，心叶扭曲，或现锯齿叶；植株矮化不明显，叶背沿叶脉有纵向不规则蜡白色瘤状突起，后变黑褐色；植株矮小，叶色稍浓绿。出现或症状的植物直接记为病株；出现症状的植株，用DOTELISA（按NY/T26312014，附录C的规定）或RTPCR检测确认（参考附录A）。49发病率计算根据三次感病对照的最高发病率确定发病率计算方式，若三次调查中感病对照最高发病率超过30，则按三次发病调查最高病株数计算发病率；若出现感病对照的最高发病率小于30，则认定本鉴定结果不可用。发病率RI表示，数值以计，按公式2计算RINI/NT100（2）式中RI发病率；NI病株数；NT总株数。计算结果精确到小数点后两位。5水稻品种抗南方水稻黑条矮缩病性状的评价51抗性分级标准抗性分级标准如下0级，发病率为0，免疫；1级，发病率为015，高抗；3级，发病率为5115，中抗；5级，发病率为15130，中感；DBXX/XXXXXXXXX47级，发病率为30160，感病；9级，发病率大于601，高感。52抗性评价当品种抗性在不同地区间、不同年度间或批次间鉴定结果表现不一致时，以最差的抗性表现为准。_DBXX/XXXXXXXXX5AA附录A（资料性附录）南方水稻黑条矮缩病毒检测技术RTPCR法A1试剂除特别说明以外，本标准所用试剂均为分析纯，所有试剂均用无RNA酶污染的容器，可用1DEPC（焦碳酸乙二酯）水处理后高压灭菌并分装。液氮可保存于液氮罐或保温桶中TRIZOLREAGENTSRNAISOPLUS，购自宝生物工程（大连）有限公司氯仿异丙醇20预冷75酒精（DEPC水配制）DEPC水用1DEPC处理后的去离子水，用于溶解RNA琼脂糖TRIS碱冰乙酸EDTA（05MOL/L）50TAE配方TRIS碱242G；冰乙酸571ML；EDTA（05MOL/L）100ML，定容至1000MLPRIMESCRIPTTMONESTEPRTPCRKIT一步反转录试剂盒购自宝生物工程（大连）有限公司DNAMARKER3（国产，购于圣比奥公司）GELRED染色工作液购于INVITROGEN公司参照使用说明进行A2仪器设备称量天平精度等级为001G高速台式冷冻离心机（离心速度12000R/MIN以上）冰箱（28和20两种）微量可调移液器（10L、100L、1000L）及配套带滤芯吸头EPPENDORF管（15ML）研砵A3检测引物正向引物SRBS10F5CCACATCGCGTCATCTCAAACTAC3反向引物SRBS10R5CGGTCTTACGCAACGATGAACC3A4试验操作A41采样工具DBXX/XXXXXXXXX6下列采样工具必须经（1212），15MIN高压灭菌并烘干剪刀，镊子，研钵，EPPENDORF管（15ML、20ML）A42样品采集用剪刀剪取新鲜水稻叶片或茎秆组织，放入密闭的自封袋内（一个采样点的样品，放一个塑料袋），尽快运回实验室4条件下保存待检，存放不能超过7D。A43样品保存新鲜样品若需长期保存应置于70以下，避免反复冻融（冻融不超过3次）。A44样品处理A441取水稻组织01G，放入研钵中，倒入适量液氮，以研磨棒将样本磨碎至粉末状，转移至EPPENDORF管中。A442加入1MLRNAISOPLUS，充分混匀。A443每1MLRNAISOPLUS加入02ML氯仿，盖好管盖，大力震荡15S，室温静置5MIN；12000R/MIN，4离心15MIN。A444吸取243各管中的上清液转移至EPPENDORF管中，切勿吸到中间层，向EPPENDORF管中加入等体积异丙醇，颠倒混匀，1530静置10MIN。A44512000R/MIN，4离心10MIN，弃上清，加入600L75乙醇，上下颠倒洗涤。A44612000R/MIN，4离心5MIN（EPPENDORF管开口保持朝离心机转轴方向放置），弃上清，倒置于吸水纸上，尽量沾干液体（不同样品须在吸水纸不同地方沾干）。A4474000R/MIN离心10S（EPPENDORF管开口保持朝离心机转轴方向放置），将管壁上的残余液体甩到管底部，小心倒去上清，用微量加样器将其吸干，一份样本换用一个吸头，吸头不要碰到沉淀，室温干燥3MIN5MIN。A448加入10L15LDEPC水，轻轻混匀，冰上保存备用。提取的RNA须在2H内进行RTPCR扩增；若需长期保存须放置70冰箱。A45检测A451扩增试剂准备在反应混合物配制区进行从试剂盒中取出相应的RTPCR反应液，,设所需RTPCR检测总数为N，其中N为被检样品、阳性对照与阴性对照的和，每个样品测试反应体系配制见下表。表2每个样品测试反应体系试剂使用量终浓度PRIMESCRIPT1STEPENZYMEMIX2L21STEPBUFFER（DYEPLUS）25LDBXX/XXXXXXXXX7正向引物SRBS10F1L04M反向引物SRBS10R1L04MTEMPLATERNA1L3LRNASEFREEDH2O补充反应体积至50LA452循环条件设置将451中离心后的PCR管放入PCR仪内，记录样本摆放顺序。循环条件设置第一阶段，反转