核酸序列分析ppt课件

尹铁球ytqstar,核酸序列分析,1,SangersMethod,Sanger(剑桥大学教授)1955年确定牛胰岛素结构1958年获诺贝尔化学奖1977年设计出DNA测序法1980年获诺贝尔化学奖合成一段与待测DNA序列互补的DNA片段,2,Sanger法第一步：加入复制终止剂,荧光检测探头,电泳，看谁跑得快,3,dNTP和ddNTP的分子结构式,ddNTPsarechain-terminatingnucleotides:thesynthesisofaDNAstrandstopswhenaddNTPisaddedtothe3end,2,3双脱氧核糖核苷三磷酸,4,Theabsenceof3-hydroxylleadtotheinefficiencyofthenucleophilicattackonthenextincomingsubstratemolecule.,5,Phosphodiesterbond,3,5,dideoxynuceotide,中止,ddNTP,生合成核酸定序法的反应,可正常连接,无法再接下去,6,7,IfoneddGTPisaddedto100dGTP,DNAsynthesisabortsatafrequencyof1/100everytimethepolymerasemeetsaddGTP,TellfromthegelthepositionofeachG,8,9,Sanger法第二步：荧光检测,10,核酸测序原理,聚丙烯酰胺凝胶电泳,TAGC,T,A,G,C,凝胶电泳可以分开各种不同长度的核酸，在电泳胶片依序排开,但这样的图谱不能判別出各核酸端点的核苷酸种类,若能把尾端核苷酸相同的片段提出，跑在同一行，则比较这样的四行，即可读出序列。,11,FourseparatereactionsdNTP+ddGTP,dNTP+ddATPdNTP+ddCTP,dNTP+ddTTPEachddNTPcarriesafluorescencegroup,allowingusto“Read”thesequencedirectlyfromthegel.,DNAsequencinggel,12,13,Automaticsequencer,FluorescenceLabeledddNTP2.Polymerasecatalyzed,13,DNA的测序仪示意图,computeranalysis,样品槽,激光器,输入光学系统,成象透镜,聚焦透镜,高灵敏度相机,旋光镜/棱镜组件,14,15,引物标记法测序(DyePrimer),一个样本，4个反应。4个反应中引物序列相同，但分别标记有不同颜色的荧光。,反应结束后，将4管反应液混合，经乙醇沉淀后上样,16,17,终止法测序(DyeTerminator),一个样本，1个反应。反应中包含分别带4色荧光标记的ddNTP(终止子),+,AmpliTaqFSdATP,dCTP,dGTP,dTTP,测序反应结束后，采用乙醇沉淀法进行纯化，除去过量的ddNTP后上样。,18,19,Sanger法测序产物的平均链长取决于ddNTP:dNTP的比例。测序反应试剂由测序试剂盒中提供，反应体系可以根据实际情况调整，一般反应体系中dNTPs的浓度远高于ddNTPs（一般1:34），比例高时，得到较短的产物。如果将待测DNA片断克隆在质粒载体上，利用引物步移延伸，从DNA片断的一端开始逐步进行序列测定，直至另一端为止。克服了鸟枪法的盲目性，并省去亚克隆制备步骤，也减轻了数据分析工作量。需要先知道上游序列的碱基顺序，才能合成适当的引物进行测序。,20,高通量测序技术又称“下一代”测序技术（Next-generationsequencingtechnology），能一次并行对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定，具有分析结果快速、准确、灵敏度高和自动化的特点。该系统的测序原理是在DNA聚合酶，ATP硫酸化酶，荧光素酶和双磷酸酶的协同作用下，将引物上每一个dNTP的聚合与一次荧光信号释放偶联起来。通过检测荧光信号释放的有无和强度，就可以对DNA序列进行实时测定。在测序时，使用了一种叫做“PTP”（PicoTiterPlate）的平板，它含有160多万个由光纤组成的孔，孔中载有化学发光反应所需的各种酶和底物。,高通量测序（High-throughputsequencing）,21,测序开始时，放置在四个单独的试剂瓶里的四种碱基，依照T、A、C、G的顺序依次循环进入PTP板，每次只进入一个碱基。如果发生碱基配对，就会释放一个焦磷酸。这个焦磷酸在各种酶的作用下，经过一个合成反应和一个化学发光反应，最终将荧光素氧化成氧化荧光素，同时释放出光信号。光信号实时被高灵敏度电荷耦合元件（Charge-coupledDevice,CCD）捕获，通过对测序数据的分析，就可以准确、快速地测定模板的碱基序列。,22,测序反应可分为四个部分：文库制备：将基因组DNA/cDNA片段化处理至400-800bp间，切割后的DNA经末端修复后，加上特定的共同接头（adapter），回收单链的DNA（ssDNA）；PCR扩增：特定比例的单链DNA文库被固定在特别设计的DNA捕获磁珠上，使每颗珠子带有自己特有的单一的DNA片段，然后在倒入的含有PCR必需试剂的乳胶颗粒中，使每个独特的片断在自己的微反应器里进行独立的扩增，而不受其他的竞争性或者污染性序列的影响。整个片段的扩增平行进行。扩增后产生了几百万个相同的拷贝。随后，洗去乳胶物质，回收纯化磁珠上的片段；,23,测序反应：将带有单链DNA的珠子与其他反应物混合后放入PTP板（fibre-opticslide）中进行后继的测序。PTP孔的直径（29um）只能容纳一个珠子（20um）。每一个与模板链互补的核苷酸的添加都会产生化学发光的信号，并被CCD照相机所捕获；数据分析：通过测序系统提供的生物信息学工具对测序数据进行分析。与传统测序技术不同之处是，这种新型的测序方法不需要对细菌进行亚克隆或者单个克隆处理，整个测序反应都是批量进行的，而且该技术不需要荧光标记的引物或核酸探针，也不需要进行电泳。,24,25,26,焦磷酸测序法的原理及应用（Pyrosequencing）,27,pyro=pyrophosphate焦磷酸一种全新的基于酶级联反应的新型遗传分析技术;一套完整的实验方案；诸多领域的广泛应用,Pyrosequencing,Pyrosequencing这项专利技术完全由Biotage公司拥有,28,PPi,ATP,PrincipleofPyrosequencing,APS,Luciferin,硫酸化酶,双磷酸酶,荧光素酶,oxyluciferin,29,Detectionofthelight,30,CGTTCCACCT,每次向反应体系中加入一种dNTP相应位置的峰代表该种dNTP的掺入情况峰高与掺入的核苷酸数量成正比多余的dNTP在加入下一种dNTP前就被降解,31,Genotypesareclearlydistinguished,32,Tri-andtetra-allelicSNPs,Genotypingoftri-allelicSNP(C/T/G),33,AdvantageofPyeosequencing,Fast,Accuracy,Flexibility,Multiplex