地中海贫血基因检测和结果分析PPT参考幻灯片

地中海贫血的实验室检测和结果分析,广西区人民医院检验科PCR实验室李友琼,1,主要内容,一、什么是地中海贫血及分布二、地中海贫血的致病机制三、地中海贫血的基因诊断四、最新的地中海贫血检测方法五、检测结果分析及报告,2,一、什么是地中海贫血,定义：由于珠蛋白基因发生缺陷，致使珠蛋白肽链合成减少或缺失，导致血红蛋白的链/非链比例失衡，而引起的一组遗传性溶血性疾病，亦称海洋性贫血。血红蛋白病：由于珠蛋白基因发生缺陷，致使珠蛋白分子的一级结构发生改变，从而导致血红蛋白的分子结构发生改变的一组遗传性疾病。地中海贫血是最常见的血红蛋白病，珠蛋白合成障碍性贫血为国内称呼，国外不用。,3,地中海贫血分类,4,地中海贫血分类,1、按照一个单倍型上的-珠蛋白基因的功能缺陷定义0地贫（也有称地贫1）：-珠蛋白基因完全基因记为-/丧失功能。+地贫（也有称地贫2）：-珠蛋白基因保基因记为-/留有部分功能。,5,地中海贫血分类,2、按照肽链内切酶分型缺失型地贫：珠蛋白肽链存在片段缺失而造成功能缺陷非缺失型地贫：珠蛋白肽链上不存在缺失，而是（点突变）由于基因的点突变造成的肽链功能缺陷,6,地中海贫血分类,3、根据基因缺失或突变个数可分为：静止型：缺失1个基因，基因型记为-/1个基因突变，基因型记为/T轻型：缺失2个基因，基因型记为：-/或-/-2个基因突变，基因型记为：T/T中间型：缺失3个基因，基因型记为：-/-缺失与突变混合，基因型为：-/T或纯合突变重型：缺失4个基因，基因型记为：-/-缺失与突变混合，基因型为：-/T,7,地中海贫血分类,1、根据肽链的功能缺失0地贫：珠蛋白基因功能完全丧失，不能合成肽链地贫：珠蛋白基因尚保留部分功能2、根据临床症状静止型地贫：突变杂合子（N/+），中国人少见轻型型地贫：突变杂合子（N/+、0/N）中间型地贫：突变双重杂合子/突变纯合子（+/+、0/+）重型地贫：突变双重杂合子/突变纯合子（0/0、0/+）,8,中国人HPFH和-地贫的基因突变类型及表型特征,9,世界地中海贫血的流行分布,10,广西地中海贫血的流行分布,Xiong,etal.ClinGenet2010,11,广西地中海贫血的流行分布,12,引起珠蛋白表达降低的常见缺失突变类型分布,MC,10kb,0kb,20kb,30kb,40kb,10kb,3HVR,interHVR,5,3,2121,THAI,BRIT,FIL,MED,SEA,4.2,3.7,2.7,SPAN,HW,27.6,11.1,2.4,13,BlackBelgianIndianMalaysian2GermanTurkishItalianGantoneseYunnaneseChineseS.E.AsianTaiwanese,0kb50kb100kb150kb,GA,LCR,引起地中海贫血常见的基因缺失突变类型分步,14,12种见于中国人群的2/1珠蛋白基因点突变,CD31,CD125,EXONI,EXONII,EXONIII,IVSI,IVSII,UTR,UTR,5,3,CD13,CD59,CD122,CD142,CD44,CD49,CD30,2,1,Missensemutation,Minideletionorinsersion,Terminationmutation,Frameshift,,CD78,CD74,CD118,15,启动子突变异常剪接起始密码突变移码突变无义突变3UTR突变,EXON1,IVS1,EXON2,EXON3,IVS2,显性突变,5,3,46种见于中国南方人群的-珠蛋白基因点突变,,16,中国南方人群最为常见的地贫类型,17,二、地中海贫血的致病机制,胎儿血红蛋白主要由两条珠蛋白链、两条珠蛋白链组成，还含有链、链、链组成成年人的血红蛋白由两条珠蛋白链和两条珠蛋白链组成,血红蛋白,18,二、地中海贫血的致病机制,19,二、地中海贫血的致病机制,人体不同发育时期的珠蛋白生成变化规律,20,二、地中海贫血的致病机制,静态突变,点突变,片段突变,动态突变,碱基替换移码突变,串联重复的三核苷酸序列随着世代的传递而拷贝数逐代累加,缺失重复重排,基因突变的分子机制,基因致病突变是地贫发生的分子基础,21,二、地中海贫血的致病机制,22,三、地中海贫血基因分析,1、Gap-PCR用于和等缺失型地贫的检测,原理：普通的酶无法扩增出长距离的片段，通过设计出与缺失序列的两侧翼序列互补的引物，当存在缺失时，由于肽链靠近从而扩增出片段。,23,24,三、地中海贫血基因分析,2、PCR-RDB用于检测和点突变,PCR,膜条,杂交,显色,25,26,三、地中海贫血基因分析,地贫基因检测的策略：地贫：先检测常见缺失型，然后检测非缺失（点突变），最后是未知的缺失和突变位点。因为90%地贫为常见的三种缺失型（-sea,-3.7,-4.2)。地贫：先检测点突变，然后检测少见的缺失型。大部分地贫都是点突变型。,27,血红蛋白病的筛查及基因诊断的技术流程,28,遗传咨询,产前地贫携带者筛查策略,同时正常,产检对象（孕妇及其配偶）,地贫分子诊断,知情同意选择,胎儿产前基因诊断,血液五分类分析（关注MCV和MCH）+血红蛋白电泳（HbA2),双方某项指标均同时降低,一方正常，另一方的指标降低,地贫全套检查,异常的一方做地贫全套检查,-地贫特征,-地贫特征,ID,双方均为-地贫特征,一方为-地贫特征，另一方为ID或-地贫特征,+,-,单纯性ID或单纯性-地贫,双方均为-地贫特征,ID或-地贫特征的一方做地贫分子诊断,夫妇双方基因诊断,血R正常的一方做地贫分子诊断,-,单纯性ID或单纯性-地贫,-,+,+,仅异常血红蛋白,必要时测序或选择其中一种地贫检测,29,四、最新的地中海贫血检测方法,1、融链曲线分析法用于检测或缺失和点突变,Thongperm,etal.JournalofMolecularDiagnostics.2010XiongF,etal.JMolDiagn.2011ChristinaV，etal.ClinicalChemistry.2003,原理：根据每条肽链都有自己的Tm值，从而可以通过温度差来判断,30,四、最新的地中海贫血检测方法,2、MLPA（多重连接探针扩增）用于寻找未知缺失断裂点,Xiao-FengWei，etal.AnnHematol.2011,31,四、最新的地中海贫血检测方法,3、毛细管电泳可以检测非缺失CS（HbCS)和E地贫,HbA,HbE,HbA2,CanLiao,etal.EuropeanJournalofHaematology.2010,32,四、最新的地中海贫血检测方法,4、DHPLC（变性高效液相色谱）用于缺失型和突变型地贫都可以,李倩，南方医科大学论文，2010,33,四、最新的地中海贫血检测方法,5、基因序列测定（PCR+毛细管电泳）用于未知突变位点或确定缺失片段的位置由于仪器比较贵重，技术要求高，目前尚未在临床一线推广，只在科研实验室里开展。,AzamAmirianMSc，etal.ArchivesofIranianMedicine.2011,34,四、最新的地中海贫血检测方法,6、母体血浆中胎儿游离核酸的测定,严提珍，国际输血及血液学杂志，2009,35,严提珍，国际输血及血液学杂志，2009,36,五、检测结果分析及报告,（一）地贫基因诊断,1、-SEA/2、/3、/4、-SEA/-4.25、-SEA/-4.26、-SEA/-3.77、/8、-SEA/9、DNAMarker,缺失型地贫电泳结果,123456789,37,非缺失杂交结果,CS纯合,WS杂合,未检测到6种突变,（注意不是正常）,38,A,B,C,D,E,F,地中海贫血点突变分析结果,39,血涂片染色（包涵体）,CornelisLH，OrphanetJournalofRareDiseases，2010,40,五、检测结果分析及报告,（三）基因诊断报告单1、临床地贫基因报告主要是常规试剂可以检测到的类型，一般都会包括被测样本的信息，检测方法，检测试剂，检测者的