动物组织RNA提取及荧光定量PCR 精讲

RNA提取及Q-PCR相关技术,主讲：宋志新,利用含有变性剂和Rnase抑制剂的有机溶剂提取RNA，是目前常用的RNA提取方法。Trizol（主要成分为异硫氰酸胍和酚），具有极强的裂解能力，可在短时间内裂解细胞和组织样本，保持样品中RNA的完整性，有效抑制RNA的降解。样品在TotalRNAExtractionReagent中能够充分被裂解，在加入氯仿离心后，溶液会形成上清层、中间层和有机层(鲜红色下层)，RNA分布在上层水相中，收集上清层后，经异丙醇沉淀便可以回收得到TotalRNA。提取的总RNA纯度高，基本不含蛋白质及基因组DNA，提取的RNA可直接用于Northern，点杂交，mRNA纯化，体外翻译，RT-PCR，以及构建cDNA文库等各种分子生物学实验。TotalRNAExtractionReagent广泛适用于培养细胞、动物组织、微生物等。下面介绍动物组织TotalRNA的提取方法,RNA提取,RNA提取,RT-PCR,Q-PCR,注意事项总结,概要,RNA提取,概要,RT-PCR,Q-PCR,注意事项总结,RNA提取,实验材料1、组织（以小鼠肝脏为例）2、RNAisoPlus（CodeNo:9108）（作用同TRIzol）3、其他：氯仿、异丙醇、75%乙醇、研钵、加样器、1.5mlEP管、枪头等。（均为RNase-free）,0.1%DEPC水,有毒,RNA提取,概要,RT-PCR,Q-PCR,注意事项总结,RNA提取,准备工作戴口罩、手套、帽子提取区域：用75%乙醇擦拭试验台试验器具：用75%乙醇擦拭加样枪准备RNase-free的枪头和离心管低温离心机预冷至4准备-20预冷的75%乙醇,RNA提取,概要,RT-PCR,Q-PCR,注意事项总结,RNA提取,RNA的提取步骤1、从小鼠体内取出肝脏，用预冷的生理盐水清洗。2、使用液氮迅速冷冻组织，-80冰箱保存。3、使用液氮充分预冷研钵。4、将称重冷冻的组织（约50-100mg）从冰箱取出后迅速放入预冷好的研钵中，用研杵研磨组织，期间不断加入液氮，直至组织被研磨成粉末状。（注：无明显的可见颗粒，如果研磨不彻底会影响RNA的收率和质量。）,RNA提取,概要,RT-PCR,Q-PCR,注意事项总结,RNA提取,RNA的提取步骤5、向研磨成粉末状的样品中加入1mlRNAisoPlus，并完全覆盖样品。（注：在加入RNAisoPlus时要保证组织没有融化，否则RNA易被RNase降解。）6、室温静置510min。7、待样品融化后，用研杵继续研磨至裂解液呈透明状。将匀浆液转移至1.5mlEP管中，室温静置5min后，4，13000rpm离心5min，将上清转移至新的1.5mlEP管中。,RNA提取,概要,RT-PCR,Q-PCR,注意事项总结,RNA提取,RNA的提取步骤8、每1ml液体中加入1/5体积（约200l）的氯仿，盖紧EP管，用手剧烈震荡15秒，直至溶液充分乳化，无分相现象。（注：不能用振荡器混匀，因为容易造成DNA和RNA的物理降解。）9、室温静置5min，4，13000rpm离心15min。10、从离心机中小心取出EP管，此时匀浆液分为三层，上层是透明的水层，RNA溶解在此层中；半固体状的中间层，此层中包含DNA；下层为粉红色的有机溶剂，蛋白质、多糖等物质溶解在此层中。,RNA提取,概要,RT-PCR,Q-PCR,注意事项总结,RNA提取,RNA的提取步骤11、将上层水相溶液小心转移至新的EP管中，大约每个EP管中能取出400500l，谨慎操作，切勿吸到中间层。（注：下层有机废液勿乱丢，收集起来统一进行无毒化处理。）12、加入等体积异丙醇，上下颠倒EP管，充分混匀。13、室温静置10min后，4，13000rpm离心10min。可在离心后的EP管底部观察到少量的白色沉淀。,RNA提取,概要,RT-PCR,Q-PCR,注意事项总结,RNA提取,RNA的提取步骤14、小心弃去上清。15、向含有沉淀的EP管中缓缓加入1ml预冷75%乙醇，轻轻上下颠倒，清洗沉淀。（动作轻柔，无需将沉淀悬浮起来）16、4，13000rpm离心5min。用移液器除去上清。17、将EP管瞬时离心，用移液器仔细将残存在EP管底部的少量液体除去。,RNA提取,概要,RT-PCR,Q-PCR,注意事项总结,RNA提取,RNA的提取步骤18、打开EP管，室温放置干燥（目的是让残留的乙醇挥发，乙醇的残留可能对后续的反应有影响）。干燥的时间不宜太久，RNA完全干燥后很难溶解19、用RNase-freeddH2O溶解沉淀。（视RNA量的多少所加RNase-freeddH2O的体积从20-200不等，肝脏组织RNA产率较高，肺组织产率低）20、RNA溶液保存在-80冰箱中。,RNA提取,概要,RT-PCR,Q-PCR,注意事项总结,RNA提取,RNA的浓度及质量检测1、浓度及纯度检测：（ThermoSCIENTIFICNANODROP1000Spectrometer）核酸在260nm附近有强吸收，蛋白质在280nm附近有强吸收。所以测定溶液在260nm和280nm下的吸光度，根据A260计算提取的核酸量，根据A260/A280的比值评价提取的核酸纯度。理想的RNA纯度A260/A280应在1.82.2范围内。低离子强度或低pH值会使OD280升高，从而使OD260/OD280值低（1.65）,RNA提取,概要,RT-PCR,Q-PCR,注意事项总结,RNA提取,RNA的浓度及质量检测2、质量检测凝胶电泳法利用1%的琼脂糖凝胶进行电泳，如果可以清晰观察到两条rRNA条带（真核生物：28S和18S；原核生物：23S和16S），且其浓度比值大约为2:1，则RNA未降解。若观察到smear现象，或比值小于2:1，则RNA已发生降解。如果观察到大于28S或23S的条带，则样品可能有基因组DNA污染，这时可以考虑使用DNaseI处理。,若有条带，可能混入了基因组DNA,28SrRNA,18SrRNA,tRNA等,DL2000DNAMarker电泳图（1%琼脂糖胶，TAE）,RNA提取,概要,RT-PCR,Q-PCR,注意事项总结,RNA提取,RNA的浓度及质量检测2、质量检测凝胶电泳法实验材料：a.提取的RNA溶液b.DL2000DNAMarkerc.6LoadingBufferd.1%的琼脂糖凝胶（加1lGoldview/20ml凝胶）e.1TAEBufferf.电泳仪g.UV凝胶成像仪,RNA提取,概要,RT-PCR,Q-PCR,注意事项总结,RNA提取,RNA的浓度及质量检测2、质量检测凝胶电泳法实验操作：1）取10lRNA原液至一个1.5mlEP管中，使用RNase-freeddH2O将其稀释至200ng/l。注：需RNase-freeddH2O体积(l)=10lRNA浓度(ng/l)/200(ng/l)-10l2）取5lRNA（200ng/l）至一个小EP管中，以供电泳使用。（注：剩余部分于-80保存备RT反应用）3）将上步的RNA70加热2min。4）冰上冷却。,RNA提取,概要,RT-PCR,Q-PCR,注意事项总结,RNA提取,RNA的浓度及质量检测2、质量检测凝胶电泳法实验操作：5）向每管中加入1l6LoadingBuffer，混合均匀。6）将琼脂糖凝胶放入到电泳槽中。7）导入1TAEBuffer，完全浸过胶面。8）点样：将管内样品全部加入到一个凝胶孔里。9）电泳：100-120V，约20-30分钟。10）凝胶成像。,RNA提取,概要,RT-PCR,Q-PCR,注意事项总结,RNA提取,RNA产率估计,RNA提取,概要,RT-PCR,Q-PCR,注意事项总结,RNA提取,RNA降解,巨噬细胞RNA,巨噬细胞RNA,动物组织RNA,逆转录PCR（RT-PCR）,概要,RNA提取,RT-PCR,注意事项总结,Q-PCR,反转录（RT）反应RNA自身不能作为PCR反应的模板，所以必须先将其反转录为cDNA。实验操作：1）将提取的RNA调整浓度为500ng/l，并于70变性2min。2）配反应体系（注意：不同的试剂盒体系不同，我们用的是TaKaRa的RR037A）20l体系5xBuffer4lOligodTPrimer1lRandom6mers1lDEPCH2O1lEnzymermix1l提取的RNA模板2l,逆转录PCR（RT-PCR）,概要,RNA提取,RT-PCR,注意事项总结,Q-PCR,反转录（RT）反应实验操作：1）RT-PCR程序：37,15min85,5s4,反转录过程,使反转录酶失活,得到的cDNA短期可在4保存数天，长期保存应在-20以下,荧光定量PCR（Q-PCR）,概要,RNA提取,RT-PCR,Q-PCR,注意事项总结,在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时在线监测整个反应进程，并结合相应的软件对未知模板进行定量分析的方法。,荧光定量PCR（Q-PCR）,概要,RNA提取,RT-PCR,Q-PCR,注意事项总结,荧光定量PCR（Q-PCR）,概要,RNA提取,RT-PCR,Q-PCR,注意事项总结,荧光定量PCR（Q-PCR）,概要,RNA提取,RT-PCR,Q-PCR,注意事项总结,QPCR,双标记探针（TaqmanProbe）,荧光报告基团（Reporter）,荧光淬灭基团（Quencher）,序列特异性,寡核苷酸探针,游离状态下，FRET效应，不发荧光,伴随产物生成，荧光积累,双标记探针（TaqmanProbe）,荧光定量PCR（Q-PCR）,概要,RNA提取,RT-PCR,Q-PCR,注意事项总结,QPCR,注意事项总结,概要,RNA提取,RT-PCR,Q-PCR,注意事项总结,常见问题及疑难解答提取RNA收率低当收率明显低于预期时，可以考虑以下原因：1）加入Trizol或RNAisoPlus后样品匀浆不充分；2）分层时水相回收率低；3）RNA沉降后与水复溶性不好；4）异丙醇沉降或洗涤过程中混入Rnase。,注意事项总结,概要,RNA提取,RT-PCR,Q-PCR,注意事项总结,常见问题及疑难解答提取的RNA难以溶解1）75%乙醇清洗沉淀后不要干燥时间过长或加热干燥；2）若难溶可以于60加热5分钟后再于冰上溶解数小时。,注意事项总结,概要,RNA提取,RT-PCR,Q-PCR,注意事项总结,常见问题及疑难解答提取的RNA降解1）提取RNA应采用新鲜的组织材料，或者用液氮