第五章 花药和花粉培养1.ppt

第五章花药和花粉培养，植物组织培养，第五章花药和花粉培养。本章的主要内容有：花粉和花药培养的概念和花粉小孢子发育途径花粉和花药培养方法的应用单倍体植株鉴定和染色体加倍；第五章花药和花粉培养；第一节花粉和花药培养的概念和应用；花粉和花药培养的概念；花药和花粉培养的历史和花药培养的应用。花粉离体培养是指在人工合成培养基上改变花粉的发育途径，使其不形成配子，而是像体细胞一样分裂/分化，从单个花粉粒发育成完全单倍体植株的技术。第五章花药和花粉培养单倍体通过体外培养花药将花粉发育成完整的植株。花药培养和花粉培养；胚珠或子房培养物(未受精)，1。概念，第5章花药和花粉培养，相似性和差异性：相似性：两种培养都有相同的目的，诱导花粉细胞发育成单倍体细胞，最后发育成单倍体植株。不同点：花药培养属于器官培养，花药是植物花的雄性器官，包括药壁和药隔组织的体细胞性质，雄性细胞的花粉粒和花粉培养属于无药壁组织干扰的细胞培养：花粉培养；可数小孢子胚胎生产率；可以观察到雄激素发育的整个过程。单倍体产量高。然而，这种技术比花药培养更加复杂和困难。2.植物花药/花粉培养的历史，Guha和Maheshwari(1964)洋金花药物培养Nitsch和Norreel(1973)烟草花粉培养(游离小孢子培养)Chu(1973)小麦花粉培养(早期花药培养主要依靠小孢子的自然胚胎发生产生单倍体，自然胚胎发生的基因频率较低，效率极低)。花卉栽培技术从20世纪80年代末到90年代发展迅速。小孢子培养在许多作物中获得了成功。十字花科植物、小麦、水稻、玉米等。在20世纪90年代，Konzak(1999)在一些以前被认为难以培养小孢子的基因型上取得了成功。通过花药培养育成的甜椒新品种：海花3号、3号。应用花药和花粉培养，1)诱导单倍体形成，快速获得纯系，缩短育种周期；第五章花药和花粉培养常规育种需要4-6年才能获得纯系，而小孢子培养只需要1年。1、作物育种，常规育种在杂种F5、F6一代开始选择；在F1或F2代进行花药培养，然后进行人工加倍处理。繁殖周期缩短了3-5年，克服了后代分离，大大缩短了繁殖周期。第二节，花药和花粉培养的应用，花粉单倍体是纯合的配子体。从配子体衍生的植物中选择基因型的概率为(1/2)n，而从常规杂种F2代群体中选择基因型的概率为(1/2)2n，因此单倍体育种的选择效率是常规育种的2n倍。2)提高目标基因型的选择效率。例如，二倍体供体植物基因型是AaBb。从后代中选择具有AAbb基因的纯合单株，传统的方法是AAbb发生的概率为1/16，而AAbb不能与Aabb和aAbb区分开来。例如：二倍体供体植物基因型是aabb，如果想从后代中选择具有aabb基因的纯合单倍体单株，aabb发生的概率是1/4。从配子体衍生植物中选择基因型的概率为(1/2)n，而从常规F2群体中选择基因型的概率为(1/2)2n，因此单倍体育种的选择效率是常规育种的2n倍。诱变育种的效果是植物不受显性和隐性影响，在现代诱变育种中可以及时获得突变个体，染色体加倍后可以获得稳定的纯系。可以探索父染色体组的组成。分析单倍体植株减数分裂过程中形成的二价体的数量和形状可以确定染色体组中是否存在同源染色体。在物种进化的研究中，单倍体植株中的基因不受显性或隐性效应的影响，以及每种效应的影响双单倍体群体是一个永久群体，可以有效地用于构建遗传图谱。可直接表达外源基因，不受显性或隐性影响。5 .用于遗传转化。2 .花粉孢子体发育途径。概念：花粉孢子体发育途径(雄激素发育途径)花粉是产生花粉植物的原始细胞。它的第一次有丝分裂基本上类似于合子的第一次孢子体分裂。花粉形成植物的途径称为花粉孢子体发育途径，也称为雄激素发育途径。首先，花粉发育的阶段。当花粉在体外培养时，雄激素发育的最合适时期通常是第一次分裂或之前。途径1)A-V途径A中小孢子的第一次有丝分裂是不等分裂，形成营养细胞和生殖细胞(1)A-V途径被营养细胞重复分裂形成单倍体(2)A-G途径被生殖细胞重复分裂形成单倍体(3)A-VG途径(E途径)被营养细胞和生殖细胞独立分裂形成单倍体(4)途径C中的营养细胞和生殖细胞通过细胞核融合形成多倍体植物。途径2)A-G途径B小孢子的第一次有丝分裂是等分裂，形成两个大小相似的细胞。然后通过两个细胞的连续分裂形成单倍体植株，或者通过核融合形成多倍体植株。1.花粉的雄核发育和形成花粉：具有胚胎发生潜力的花粉。雄激素发育和饥饿处理饥饿处理改变了小孢子配子体发育的方向并启动了雄激素的发育。(1)胚状体发育途径小孢子经历不同阶段的胚胎发生，最终子叶扩展形成花粉植株。2.愈伤组织发育途径小孢子分裂数次形成愈伤组织，然后分化形成花粉植株。通过这种途径生产的植物会有变异和复杂的倍性。(4)花粉植株形态发生，胚状体发育途径，部分花药通过胚状体途径形成植株，烟草花药培养，再生形成植株通过胚状体途径，烟草花药培养，胚状体发育途径，芸薹属小孢子培养，愈伤组织发育途径，部分花药产生愈伤组织，水稻花药接种在平板上，水稻花药培养，水稻花药培养，第三节花粉和花药培养方法，1。花药培养。花粉培养。白化病4。影响花粉雄核发育和花药培养的因素。花药培养1。材料的显微镜检查。根据花粉的发育期选择合适大小的芽。2.用70%酒精消毒花蕾表面，或用70%酒精浸泡30-60秒后，用1%次氯酸钠溶液浸泡10-20分钟或用0.1%氯化汞溶液浸泡3-10分钟，用无菌水冲洗3-5次。3.培养固体或液体培养基。该方法包括以下步骤：脱分化培养至小孢子大量分裂形成胚或愈伤组织，并突破花药壁表面形成突起(2-3周)；然后，将其转移到分化培养基中培养形成小植株。花粉培养(1)花粉的分离纯化(1)自然分散法(通过漂浮培养收集分散的小孢子)将花药接种在预处理液或液体培养基上，待花粉自动分散后，收集培养花药。2.用挤压法在烧杯或研钵中挤压花药，挤压后收集培养花粉。(1)磁力搅拌法用磁力搅拌器搅拌培养液中的花药，使花粉游离；2)超速旋转切割法通过搅拌器中的高速旋转切割器来破碎花蕾、穗和花药以释放小孢子(这种方法使用最广泛)。(4)小孢子纯化)将通过上述方法获得的小孢子混合物进行分级筛选和梯度离心以纯化小孢子；(3)机械解离；梯度离心前(小孢子形态和活力不一致)；30%蔗糖梯度离心后(获得均匀的小孢子群体)；(2)花粉培养法；(1)平板培养花粉在琼脂固化培养基上培养。2.液体培养花粉悬浮在液体培养基中，需要摇动以促进通气。3.双层培养花粉在固液双层培养基上培养。培养基的制备方法为护理培养利用花药或花药愈伤组织释放的活性物质促进花粉小孢子发育。一片活跃生长的愈伤组织被用来照顾单个细胞，使其生长和增殖。这种愈伤组织块称为护理愈伤组织，1)将一定量的厚固体培养基加入培养瓶中，灭菌备用。2)在无菌条件下，将一小块(1cm3)活跃生长的愈伤组织接种到培养基上，然后将一块(1cm3)无菌滤纸放在愈伤组织块上，放置过夜。3)将分离的花粉接种到已经完全吸收愈伤组织渗透物的滤纸上。4)单细胞分裂形成肉眼可见的小细胞团后，转移到新鲜培养基中培养，恒温培养，得到单细胞克隆。具体方法，2、护理培养图，5、微室培养采用小盖玻片和袖珍玻片形成微室进行花粉培养。6.条件培养基在含有培养花药的液体培养基或含有灭活花药提取物的培养基上培养。花药条件培养基、子房条件培养等。微室培养图：平面图，花粉培养过程，花芽(显微检查)，花药，第一节花药和花粉培养技术，3，白化苗现象，(1)白化苗发生的影响因素和机理，(1)内供体植株基因型(如籼稻比粳稻白化苗比例高)，花粉发育期。2.外部因素预处理、培养基组成、激素水平和种类、培养条件和方法、愈伤组织分化时间等。3.核基因的机制起着关键作用，导致质体DNA的缺失和白色幼苗的产生。此外，克隆变异也可能是原因之一。(2)白化苗的控制受花粉发育期、预处理和培养基组成等因素的调节。(1)植物基因型是影响雄性核发育的最重要因素之一。同一物种不同基因型对离体小孢子诱导的反应不同。例如，在水稻中，籼稻的花粉培养能力远低于糯米。小孢子发育阶段对于诱导雄激素的发育非常重要。(3)花粉发育期，适应期：单核期，尤其是单核中期和晚期(单核侧卧期)，不同基因型十字花科芸苔属植物小孢子胚发生率的比较，topa100，000-200，0001-20 westar1000-10，0000.1-1 delta 100-10，0000.01-1 bonty 10-1000.001-0.01，基因型胚状体数/106个小孢子一般来说，最好是在合适的生长条件下(如温室)。但是物种之间有差异。2.植物生长期通常在开花开始时比开花结束时好。3.不同温度、日照时数、氮饥饿和生长物质处理增加了磷花粉的数量。(2)供体植物的生长条件和生理状态。随着细胞体积迅速增加，细胞核从中心位置向一侧移动，即单核期。四分体：醋酸品红染色、四分体：亚历山大染色、单核期、双核期、成熟花粉粒、烟草小孢子处于不同的发育阶段，一般来说，单核期(第一次有丝分裂前)对诱导反应最敏感，是最佳培养阶段。双核形成后，胚状体主要由营养细胞在适当条件下分裂产生。不同物种诱导胚胎发生的最佳小孢子发育时期。培养和测试不同发育阶段的花药，以确定最佳小孢子发育时期的形态特征。注意形态特征会因品种、发育状况和环境条件的变化而改变。不同发育阶段的烟草花蕾、花粉发育时期的确定和单核期的确定：根据细胞观察，推测淀粉开始在双核期的花粉中积累，不能使花粉发育成植物。品红乙酸盐或碘化钾通常用于染色和压片，用于显微镜检查以确定花粉发育时期。然而，不可能在接种前对发育期间的所有花粉进行显微镜检查。通常，一定尺寸的a .通过显微观察、品红醋酸染色、DAPI染色确定小孢子发育时期；b .通过花芽的外部特征确定小孢子发育时期，花芽的外部形态特征与小孢子发育时期有一定的相关性，花芽花萼裂基部与花冠顶部的差异可作为判断小孢子发育时期的基本指标。预处理是小孢子培养成功的先决条件。预处理的目的是改变小孢子发育的方向，使尽可能多的小孢子从配子体发育途径转移到孢子体发育途径(即成为具有胚胎发生潜力的小孢子)。适当的预处理可以大大提高绿苗的产量。预处理方法：花药主要经过中度胁迫处理，包括低温、高温、化学物质、离心、辐射等。(4)预处理，1。高低温处理和低温冷藏是最常用的方法，用于从健康和无疾病的植物中收集芽，用湿纱布包裹芽，将其放入塑料袋中，然后冷藏。低温处理可阻止小孢子的正常分化，显著增加单核状态的花粉数量，有利于愈伤组织和胚状体的诱导分化。实施例：没有低温预处理的十字花科植物的芽每花药有4.39个胚。在6-9处理1天后，产生的胚胎数增加到61.4个。预处理4天后，胚状体产量降至10.47。预处理方法：高温处理(热激处理):指花药接种，在较高温度(30-35)下培养数天，然后移至常温继续培养。例：如烟草，32高温；小麦在33预处理显著提高了小孢子胚胎发生(Touraev，1996)。2.化学处理，包括高糖、甘露醇、秋水仙碱、乙烯利等。甘露醇只能维持渗透压，但不能提供碳源。其主要原理是造成小孢子营养缺乏，从而使小孢子脱分化。3、其他，包括伽马射线、离心、磁场等。(5)中等，1。基本培养基主要是N6和MS培养基。培养基：适合双子叶植物的花药培养；B5培养基：适合豆科和十字花科的花药培养；N6培养基：适用于谷类作物的花药培养。Nitsch培养基：适用于芸苔和曼陀罗。高浓度NH4显著抑制花粉愈伤组织的形成。铁盐对花粉胚状体的发育非常重要。活性炭促进胚状体发育。包括蔗糖、麦芽糖、纤维二糖、葡萄糖、果糖、海藻糖等。不同作物所需的最合适碳源的类型和浓度的差异。在辣椒花药培养中，6%蔗糖浓度时胚状体诱导率最高。在番茄花药培养中，这一要求高达14%。原因是花粉母细胞的渗透压高于丝状体细胞，即高浓度的蔗糖不利于药壁和丝状体细胞的生长，但有利于花粉的生长。人们普遍认为单子叶植物比双子叶植物需要更多的糖。蔗糖在玉米中效果最好。麦芽糖似乎是小麦作物的最佳碳源。高浓度蔗糖可以诱导花粉形成愈伤组织。较低浓度的蔗糖可使愈伤组织分化成苗。碳源和激素细胞分裂素能促进胚状体的形成。生长素可以诱导愈伤组织的形成。当细胞分裂素与生长素的比例较高时，可以诱导愈伤组织分化苗4、氨基酸5、活性炭6和酸碱度，(6)培养条件，1。不同物种在温度上有差异。培养温度约为25 28。2.光暗交替培养，每天光照12 18小时，光照强度200010000lx。3.种植密度种植密度与花卉栽培效率有很大的相关性。5103至2104个/毫升的密度可有效培养。一般来说，足够数量的相对低密度的小孢