RNA干扰及小分子RNA作用

核糖核酸干扰的应用及小分子核糖核酸的作用摘要：核糖核酸干扰是指在进化过程中，由双链核糖核酸诱导的高度保守、高效和特异的同源核糖核酸降解。由于RNAi技术可以特异性地消除或关闭特定基因的表达，因此它已被广泛用于探索基因功能和用于感染性疾病和恶性肿瘤的基因治疗。SiRNA是细胞质中的一种内切核酸酶，将dsRNA切割成许多具有特定长度和结构的小片段RNA(约21-23 BP)，并具有介导mRNA切割的功能。微小核糖核酸是一种20 24 nt的单链小分子核糖核酸，是一组不编码蛋白质且没有开放阅读框的短序列核糖核酸。关键词：核糖核酸siRNA核糖核酸核糖核酸一度被认为只是脱氧核糖核酸和蛋白质之间的“过渡”，但越来越多的证据表明，核糖核酸在生命过程中发挥着比我们早先认为的更重要的作用。核糖核酸干扰的发现使人们对核糖核酸在调节基因表达中的作用有了新的认识。随着另一类小分子核糖核酸微核糖核酸(miRNA)研究的突破，核糖核酸已成为当今世界的研究热点之一。近年来，对核糖核酸干扰的研究取得了突破性进展。它被Science杂志评为2001年十大科学进步之一，并在2002年十大科学进步中名列第一。由于RNAi技术可以特异性地消除或关闭特定基因的表达，因此它已被广泛用于探索基因功能和用于感染性疾病和恶性肿瘤的基因治疗。1.核糖核酸干扰与siRNA1.1核糖核酸是指进化过程中的一种高度保守现象，它是由双链核糖核酸(ds核糖核酸)和同源核糖核酸的高效和特异性降解诱导的。近年来，真核基因的转录后关闭(沉默)现象也得到了深入研究，在理解基因表达调控机制方面取得了新的突破，其中最重要的是20世纪90年代后期的明显的RNA干扰。科学家们发现，当反义核糖核酸被用来阻止相应核糖核酸的蛋白质翻译时，结果是不稳定的。甚至有义核糖核酸有时也能阻止核糖核酸翻译蛋白质。这使得美国学者Fire和Mello怀疑可能阻止mRNA翻译的不是单链RNA，而是混合痕迹双链RNA。进一步的实验证明，只有少量的双链核糖核酸可以干扰线虫相应基因的表达，而即使是大量的单链核糖核酸(无论是反义还是正义的)也没有明显的效果。后来澄清说，这具有普遍意义：双链核糖核酸是基因关闭的有效启动子。外源基因如病毒基因、人工转移基因、转座子等随机整合到宿主细胞的基因组中，当宿主细胞进行转录时，往往会产生一些dsRNA。宿主细胞会立即对这些双链核糖核酸作出反应。Dicer是细胞质中的一种内切核酸酶，将dsRNA切割成许多具有特定长度和结构的小片段RNA(约21-23 BP)，即siRNA。SiRNA在细胞内RNA解旋酶的作用下解聚成有义链和反义链，然后反义siRNA与体内的一些酶(包括核酸内切酶、核酸外切酶、解旋酶等)结合。)形成核糖核酸诱导的沉默复合物(RISC)。RISC特异性结合外源基因表达的mRNA的同源区域。RISC具有核酸酶的功能，在结合位点切割mRNA，结合位点是siRNA反义链的两端互补。被切割的信使核糖核酸立即降解，从而诱导宿主细胞降解信使核糖核酸。SiRNA不仅可以指导RISC切割同源单链mRNA，还可以作为引物，在依赖于RNA的RNA聚合酶的作用下，与靶RNA结合，合成更多新的dsRNA。新合成的dsRNA被Dicer切割，产生大量的二级siRNA，从而进一步放大RNAi的作用，最终完全降解靶mRNA。胡海燕等发现，体外转录合成的siRNA能抑制A549和NCI-H460细胞中bcl-2基因的表达，抑制率达50%以上。1.2 RNAi具有以下特征： RNAi是转录后水平的基因沉默机制；(2)核糖核酸具有高特异性，只降解核糖核酸；对应于其序列的单个内源基因；(3) RNAi高效抑制基因表达，表型可达到缺失突变表型的程度，相对少量的dsRNA分子(其量远小于内源性的信使核糖核酸的量)可完全抑制相应基因的表达，这是以催化扩增的方式进行的；(4) RNAi可以通过跨越细胞边界，在不同细胞间远距离传递和维持信号，甚至扩散到整个生物体并可遗传，从而抑制基因表达。dsRNA不得短于21个碱基，长链dsRNA也被细胞内的双酶切至约21 bp siRNA，mRNA切割由siRNA介导。此外，大于30 bp的dsRNA不能在哺乳动物中诱导特异性RNA干扰，但是细胞非特异性和综合基因表达被抑制并且发生凋亡。三磷酸腺苷依赖性：在去除三磷酸腺苷的样品中，核糖核酸干扰的减少或消失表明核糖核酸干扰是一个三磷酸腺苷依赖性过程。这可能是因为狄瑟氏菌和RISC之间的酶消化反应必须由三磷酸腺苷驱动。1.3由于RNAi技术可以特异性消除或关闭特定基因的表达，因此它已被广泛用于探索基因功能和用于感染性疾病和恶性肿瘤的基因治疗。在HIV-1的基因治疗研究中，乙肝、丙肝等。使用RNAi技术，发现在病毒基因组中选择与人类基因组没有同源性的序列作为抑制序列可以抑制病毒复制，同时避免对正常组织的毒副作用。同时，在特定位点选择抑制序列可以诱导某些具有明确基因突变的恶性肿瘤细胞凋亡，如含有BCL/ABL或AML1/MTG8融合基因的白血病细胞。另外，肿瘤特异性启动子如hTERT启动子、生存素启动子或组织特异性启动子如酪氨酸酶启动子和骨钙素启动子可用于指导siRNA或shRNA针对某些癌基因或抗凋亡分子的表达，从而达到特异性杀伤肿瘤细胞的目的。目前，国内外研究人员用核糖核酸干扰技术沉默hTERT的报道主要包括：宋等将含hTERT的腺病毒载体转移到腹膜癌增殖小鼠体内，发现hTERT的核糖核酸量减少了4倍，血管生成和转移相关基因及bcl-2基因的表达量减少；Canales BK等人发现，在雄激素非依赖性前列腺癌模型中转染癌细胞50天后，癌细胞生长被抑制，凋亡显著发生，端粒酶活性被抑制，并且与siRNA的剂量成比例。Shammas MA等用siRNA和质粒电穿孔转染HeLa细胞，癌细胞的不死性被逆转，端粒酶活性降低，端粒长度减少，细胞数量减少，细胞生长停止。在我国，RNA干扰技术和端粒酶逆转录酶基因的研究方法基本相同。研究对象包括肝癌、宫颈癌、神经胶质瘤、胃癌细胞等。结果表明，采用核糖核酸干扰技术后，癌细胞凋亡率明显增加，细胞生长受到抑制，表明该方法在临床上具有广阔的应用前景。2.核糖核酸，snoRNA和核糖核酸2.1小分子核核糖核酸是真核细胞细胞核中的一组小分子核糖核酸。它的分子很小，含有大约50-200个核苷酸，所以被称为小核核糖核酸。小核糖核蛋白(snRNP)是由它们与相关蛋白质结合形成的，在处理核糖核酸前体和去除多余片段(如内含子)中起着重要作用。核糖核酸在细胞核中转录，但核糖核酸在细胞质中组装并在细胞核中发挥作用，因此它需要穿过核膜。在细胞核中，snRNP可被鉴定为真核相关核糖核酸前体内含子的3个保守序列：头端(5端，大部分是谷蛋白起始端)、尾端(3端，大部分是谷蛋白终止端)和分支点(靠近尾端，富含)，从而形成剪接复合物用于精确切除。一个典型的剪接复合体由五个SN RNP组成，每个SN RNP由一个snRNA(分别对应于U1、U2、U3、U4、U5和U6)和6至10个对应的蛋白质组成。2.2小核仁核糖核酸(snoRNA)是在核仁中发现的第一个小核糖核酸，其生物学功能最初被发现是修饰核糖核酸。大多数小核仁核糖核酸可分为两种类型。一个是snoRNA，它被甲基化成核糖核酸的碱基。其特征在于包含四个盒子：盒子c，盒子D，盒子c 和盒子D 。事实上，snoRNA预测的碳D盒已经有许多已发布的软件，如snoscan。另一种是基于核糖核酸进行甲基尿嘧啶修饰的snoRNA盒。其特征在于形成一个双干，在中间增加一个环区，在环区中间增加一个boxH。尾巴上有一个盒子。因为boxH和boxACA的主要序列特征是松散定义的。例如，BoxH是ANANNA，许多丰富的区域可以满足这个特性。然而，boxACA是一个仅有3个确定信息基的神经网络。因此，仅从一级序列特征来判断一个核糖核酸是否是snoRNA是一种比较。容易出错。幸运的是，hacasorna的二级结构非常清楚。因此，结合二级结构和尾部的盒形蚁群算法的特点来共同判断一个核糖核酸是否是HACAsnoRNA是可行的。细胞中snoRNA的含量相对较高，种类也相对丰富。这些snoRNA基因的缺失不会导致细胞死亡，甚至很难观察到表型变化。现在看来，它的修饰不仅仅是核糖核酸，还包括核糖核酸、核糖核酸和许多其他种类的核糖核酸。它们的功能多样性正在逐渐被理解。2.3小细胞质RNA(scRNA)长约300个核苷酸，也称为7SL-RNA，主要存在于细胞浆中，在粗面内质网上的蛋白质定位和合成中起重要作用。众所周知，分泌蛋白和膜蛋白在内质网中合成，然后通过囊泡运输，这与相关蛋白中的信号肽(序列)有明确的关系。20世纪80年代中期，在真核细胞中发现的单链RNA使人们了解了内质网膜上的信使核糖核酸和核糖体定位的机制：单链RNA和相关蛋白质一起形成一个复合物，可以特异性识别结合信号肽，因此被称为信号识别颗粒(SRP)；SRP不仅识别信号肽，还结合核糖体，暂时阻断多肽链的合成。它可以进一步与粗面内质网膜上的SRP受体(也称为码头蛋白)结合，介导核糖体和信号肽与膜上的核糖体结合蛋白和蛋白通道结合，核糖体位于粗面内质网中；然后SRP与受体分离，进入新的循环，信号肽引导蛋白质序列继续合成内质网腔。3.miRNA3.1 miRNA是一种20 24 nt的单链小分子核糖核酸，它是一组短序列核糖核酸，不编码蛋白质，也没有开放阅读框。成熟的miRNA在5端有一个磷酸基团，在3端有一个羟基。三个研究组分别从线虫、果蝇和Hela细胞中鉴定出100多个新的miRNA，其中15%跨越线虫、果蝇和哺乳动物的基因组，并且高度保守。在这些高度保守的片段中，只有1-2个碱基的差异(如表1所示)。Lau和Bartel(miRNA的发现者之一)的同事认为，所有的miRNA在其他物种中都可能有同源基因(Orhtolog指的是一组起源于同一祖先并在不同生物体中发挥相同功能的基因，这些相似的基因被称为“同源基因”)。研究者认为这种高度保守性与其功能的重要性密切相关，也为生物早期进化的同源性提供了一些证据。3.2目前认为，miRNA作用的可能机制是首先在双酶的参与下，将茎环约为70 nt的稳定前体加工成稳定的双链核糖核酸分子，然后迅速降解成约22 nt的单链核糖核酸分子，然后被PPD(PAZ piwi结构域)蛋白家族成员识别和结合，形成PNA-蛋白复合物。也就是说，miRNA核蛋白前体(miRNP)，然后成熟的miRNA以反义核糖核酸的形式与靶基因3UTR结合，引起翻译抑制。在整个加工过程中，双酶的识别和加工需要三磷酸腺苷能量供应，而蛋白质家族的识别和结合不需要三磷酸腺苷能量供应。成熟的miRNA与靶miRNA的3非翻译区(UTR)有互补和配对的位点。两者的识别和结合使得翻译不可能，从而抑制基因表达。然而，一些研究结果表明，一些miRNA可以结合到开放阅读框架的mRNA。这种下调机制导致发育过程中某些蛋白质的数量急剧减少，从而成为下一个发育阶段的标志。3.3目前，miRNA的功能需要进一步研究。从已知的研究来看，它的主要功能是调节动植物的生长发育。到目前为止研究的是lin-4和let-7在线虫发育中的作用。Lin-4与lin-14和lin-28的3非翻译区(UTR)互补，从而暂时下调LIN-14蛋白的表达水平，并将线虫从L1转化到L2。Let-7核糖核酸长度为21个核苷酸，不存在于L1和L2期。它出现在L3早期，在L4和成人期达到高峰表达。与lin-14、lin-41、lin-42和daf-2的3非翻译区(UTR)互补，LIN-41的蛋白水平降低以减轻lin-29的抑制并促进线虫从L4向成虫的转化。Gary报道了lin-4和let-7的缺乏或过度表达将导致时间表型，即改变发育过程中的速度调节过程。简而言之，miRNA可能在基因表达调控中发挥意想不到的重要作用。3.3 siRNA很容易与miRNA结合，因为它也是一种双链RNA，长度为21-25 nt，取决于双酶。SiRNA具有很强的关闭基因的功能，可以介导RNA干扰，降解特定的靶mRNA，使细胞能够抵抗外来基因的入侵和病毒感染。然而，两者之间存在一定的差异：成熟的miRNA以单链形式存在，而成熟的siRNA以双链形式存在。(2) miRNA在正常条件下参与生长和发育基因的调节，而siRNA不参与生物体的正常生长，仅在病毒或其他双链RNA的诱导下产生。(3) miRNA在转录后水平和翻译水平发挥作用，而siRNA的作用仅在转录后水平调节。(4)双酶对两种核糖核酸的加工不同。miRNA是不对称加工的，它只来自于茎环RNA前体的一侧臂，其余的降解很快。siRNA是对称加工的，它来自双链核糖核酸前体的两个侧臂。最近的研究发现了miRNA和siRNA之间的某种联系