《分子生物学实验》教学大纲

分子生物学实验教学大纲课程名称：分子生物学实验课程编号：12030010课程类别：专业基础课/必修课学时/学分：24/0.75开设学期：第五学期说明一、课程性质专业基础课/必修课二、教学目标本课程以培养学生掌握生物技术与分子生物学研究的基础实验技能为主要目标，力图最大限度地利用我院现有的实验条件，通过本课程的学习和实践，学生能够：1.接触和掌握从事生物技术研究所必要的实验手段；2.熟悉基因工程的主要操作方法和步骤；3.通过有限的实验室实践，加深对分子生物学主要理论的理解；4.掌握分子生物学常用仪器设备的操作和应用能力，为今后从事教学、科研及技术开发打下坚实的基础。三、学时分配表序号实验项目实验时数实验类型内容与要求小计实验1基因组DNA的提取6验证性利用CTAB法提取植物基因组DNA、紫外吸收法测定其含量。通过实验掌握植物基因组DNA提取及纯化的原理和方法。?实验2PCR基因扩增6综合性利用PCR扩增目的基因。通过实验掌握 PCR 反应的基本原理与技术；掌握琼脂糖凝胶电泳技术。实验3感受态细胞的制备及转化6综合性以CaCl2制备E.coli DH5感受态细胞，利用pMD18-T载体与实验2扩增的目的片段连接，转化DH5a 菌株。用-互补现象和抗性筛选初步筛选转化子。通过本实验，学习CaCl2制备感受态细胞的方法；掌握DNA重组、细菌转化以及蓝白斑筛选的原理和技术。?实验4质粒DNA的提取及电泳检测6综合性将实验3筛选到的转化单菌落进行培养、从培养的大肠杆菌中提取质粒、酶切、电泳进行转化子的鉴定。合计24四、实验方法与要求建议本课程采用传统的实验教学方法，4人一组操作，结合小组讨论与集体讨论、实验设计、分子生物学小知识和小技巧介绍等多种教学手段，帮助学生通过本课程的学习全面地掌握分子生物学的基本实验方法与技能以及实验设计的思路，提高学生从事科学研究的综合素质。要求学生认真预习，熟悉实验的内容，了解所用的仪器用具；实验中严格按操作规程进行，仔细观察，及时记录实验现象及结果，认真做好每一天的实验报告；实验结束后仔细分析和总结实验结果；使用贵重精密仪器时，应严格遵守操作规程，对任何自己不熟悉的实验仪器都不要随意操作（尤其是微量移液器）；在操作过程中发现任何意外现象都要及时向任课教师报告；在实验过程中制造的任何垃圾都要丢到垃圾筐里（或先放在自己的桌面废物缸内），严禁随地投弃！五、考核方式及要求1.考核方式：考试（）2.成绩评定：记分制：百分制（）成绩构成：实验成绩（100分）=实验预习（10）+实验态度、卫生、安全（10）+实验操作（25）+实验报告（25）+实验考试（30）。重点考察学生对分子生物学实验基本理论和实验技能的理解、掌握及其灵活应用的能力。本文实验一 基因组DNA的提取一、实验性质实验类别：专业基础课/必修实验类型：验证性计划学时：6学时实验分组：4人/组二、实验目的1.学会离心机、移液器等分子生物学常用仪器设备使用方法；2.掌握总DNA 的提取及纯化技术；3.掌握紫外吸收法测定DNA含量的方法。三、实验的基本内容和要求（一）实验的基本内容1.提取DNA、纯化2.紫外分光光度计检测DNA含量及纯度。（二）要求：通过实验掌握植物基因组DNA提取及纯化的原理和方法；学习用紫外分光光度计检测DNA含量及纯度。四、实验仪器设备及材料1.仪器设备：液氮，恒温水浴，离心机，制冰机，紫外分光光度计。2.材料：新鲜的或冷冻的植物材料。五、实验操作要点（CTAB法）1.将0.5克嫩叶（菠菜、灰条等）叶片加入少许提取液研磨（放入液氮预冷的研钵中，在液氮中研碎更好），收集到离心管中，装入的组织少于1/2离心管；2.向装有材料的离心管加入等体积（或稍多）预热的CTAB提取液，置于65水浴30 min；3.室温下冷却，加等体积的氯仿-异戊醇（24：1）混合液，颠倒混匀，至溶液成乳化状态。4.室温5000rpm，离心10min，将上清液移至新的离心管；5.取上清，重复步骤3，重抽提一次或数次；6.取上清，加5M NaCl 1ml，混匀，再加2/3体积的异丙醇（预冷），颠倒混匀，等待沉淀，甚至可以过夜（-20）；7.12000rpm离心10min，弃上清；8.沉淀中加入等体积的70%乙醇，洗涤沉淀；9.12000rpm离心10min，挥干乙醇。（自然风干或真空抽干DNA样品）；10.加适量0.1TE，溶解沉淀（也可再加入RNase），-20保存；11.紫外分光光度计测DNA样品的纯度、浓度A260/ A280=1.8-1.9, 意指高纯度的DNAA260/ A280=1.9-2.0, 意指高纯度的RNA而1 OD260相当于50ug/ml的双链DNA，40ug/ml的单链DNA或RNA.根据公式可计算DNA浓度：C(ug/ml)= A260/0.02注： 若所制样品较浑浊，可用24：1的抽提液再抽提一次，离心，异丙醇（预冷）再沉淀DNA，70%乙醇洗涤沉淀，离心，挥去乙醇。 若分光光度计测DNA样品的纯度不高，也可用以上方法处理。六、实验教学建议不同生物（植物、动物、微生物）的基因组DNA的提取方法有所不同，不同种类或同一种类的不同组织因其细胞结构及所含的成分不同，分离方法也有差异。在提取某种特殊组织的DNA时必须参照文献和经验建立相应的提取方法，以获得可用的DNA大分子。尤其是组织中的多糖和酚类物质对随后的酶切、PCR反应等有较强的抑制作用，因此用富含这类物质的材料提取基因组DNA时，应考虑除去多糖和酚类物质。DNA提取过程中，所有操作均须温和，避免剧烈震荡。实验二 PCR基因扩增一、实验性质实验类别：专业基础课/必修实验类型：综合性计划学时：6学时实验分组：4人/组二、实验目的1.掌握聚合酶链式反应的基本原理和实验技术方法。2.学会常用的DNA琼脂糖凝胶电泳。三、实验的基本内容和要求（一）实验的基本内容1.建立PCR 反应体系2.扩增3.琼脂糖凝胶电泳：实验用具和溶液均有可能受到EB的污染，操作过程应带手套。（二）要求：掌握 PCR 反应的基本原理与技术；掌握琼脂糖凝胶电泳技术。四、实验仪器设备及材料1.仪器设备：PCR热循环仪、琼脂糖凝胶电泳系统、凝胶成像系统。2.材料：实验一提取的DNA。根据目的基因两端的序列设计引物进行扩增。五、实验操作要点（一）建立PCR 反应体系：在冰浴中，按次序将各成分加入一无菌的0.5m L离心管中。试剂体积（ul）终浓度10X PCR buffer2.01X25mmol/LMgcl21.01-5mmol/LdNTP1.00.5-1mmol/LP1+P20.5+0.5各0.5ummol/LTag0.320单位摸板DNA0.250ugddH2O14.5总体积20视PCR仪有无热盖，不加或添加石蜡油。（二）扩增程序：94 变性 30s45-70 退火30s 25-35个循环。4保存1-2h或-2070-75 延伸不超过90s 长期保存备用。（三）扩增产物的检测：用0.8%-1.0%琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物。 (1).称取适量琼脂糖于适量0.5TAE中，在微波炉中使琼脂糖颗粒完全溶解，冷却至45-50时倒入制胶板中；(2).凝胶凝固后，小心拔去梳子；(3).将电泳样品与溴酚蓝混合后将样品依次点入加样孔中；(4).将制胶板放入电泳槽中，加入电泳液，打开电泳仪；(5).电泳完成后切断电源，取出凝胶，放入0.5g/ml 的溴化乙锭（EB）溶液中染色1015min，清水漂洗后置于凝胶成像系统观察电泳结果。六、实验教学建议1. PCR反应应该在一个没有DNA污染的干净环境中进行。2. 纯化模板所选用的方法对污染的风险有极大影响。一般而言，只要能够得到可靠的结果，纯化的方法越简单越好。3. 所有试剂都应该没有核酸和核酸酶的污染。操作过程中均应戴手套。4. PCR试剂配制应使用最高质量的新鲜双蒸水，并高压灭菌。5. 试剂都应该以大体积配制，试验一下是否满意，然后分装成仅够一次使用的量储存，从而确保实验与实验之间的连续性。6. 试剂或样品准备过程中都要使用一次性灭菌的塑料瓶和管子，玻璃器皿应洗涤干净并高压灭菌。7. PCR的样品应在冰浴上化开，并且要充分混匀。8. 为了节省时间，具体的扩增参数根据扩增基因的不同由老师通过预备实验优化反应体系，学生实验按优化的PCR条件操作。实验三 感受态细胞的制备及转化一、实验性质实验类别：专业基础课/必修实验类型：综合性计划学时：6学时实验分组：4人/组二、实验目的通过本实验，学习和掌握CaCl2制备感受态细胞、细菌转化以及蓝白斑筛选的原理和技术。三、实验的基本内容和要求以CaCl2制备E.coli DH5感受态细胞，利用pMD18-T载体与实验二扩增的目的片段连接，转化DH5a 菌株，用-互补现象和抗性筛选初步筛选转化子。通过本实验，学习和掌握CaCl2制备感受态细胞、细菌转化以及蓝白斑筛选的原理和技术。四、实验仪器设备及材料超净工作台、低温离心机、恒温摇床、高压灭菌锅、恒温水浴锅、培养皿、E.coli DH5、pMD18-T载体及其配套的连接液等。五、实验操作要点（一）大肠杆菌感受态细胞的制备1. 取一支无菌的三角烧瓶，在超净工作台中加入20ml LB（不含抗菌素！）培养基。2. 从超低温冰柜中取出DH5菌种，放置在冰上。在超净工作台中用烧红的接种环插入冻结的菌中，然后接入培养基中，37摇床培养过夜。3. 取0.5ml上述菌液转接到含有50ml LB培养基的三角烧瓶中，37下250r/min摇床培养至对数生长期。测定OD590为0.375（0.4-0.6，细胞数108/ml，此为关键参数！）。以下操作除离心外，都在超净工作台中进行。4. 将菌液分装到1.5ml预冷无菌的聚丙烯离心管中，于冰上放置10min，然后于4，4000rpm离心2min。5. 将离心管倒置以倒尽上清液，加入0.5 ml冰冷的0.1 mol/L CaCl2溶液，立即混匀，插入冰中放置30min。6.4，4000rpm离心2min，弃上清液后，用100l 冰冷的0.1 mol/L CaCl2溶液重悬，插入冰中放置30min。可以直接用作转化实验，或立即放入-80超低温冰柜中保藏（可存放数月）。（二）DNA重组：将实验二的PCR产物连接在pMD18-T载体上（按TaRaKa公司提供的pMD18-T载体的使用说明进行操作）。（三）细菌转化及转化子的筛选1.取一管感受态细胞于冰上冻融后，于无菌条件下加入10L的连接产物，轻轻混匀后，冰浴30min，同时设置两个对照：其中一个在相同条件下加入已知质粒作阳性对照，也可同时检测感受态细胞效价（每ug质粒DNA转化出的菌落数）；另一个加无菌水作阴性对照。2.42水浴静置热激45秒。3.将管迅速转移至冰浴中，冰置1min。4.往管中加入890L LB液体培养基，37摇床上，150rpm，温育60min，使细菌复苏。5.吸取200L菌液铺于含Amp、Xgal-IPTG的琼脂平板上。待液体完全浸入培养基后，倒置平板在37培养1216h。六、实验教学建议1.掌握好细菌生长状态和密度。以刚进入对数生长期为好，通过检测培养液的OD590来控制。2. CaCl2需最高纯度的（GR.或AR.），并用超纯水配制，最好分装保存于冷暗处。3.所有操作均应在无菌条件和冰上进行。4.为节约时间，DNA重组由教师事先完成。实验四 质粒DNA的提取及电泳检测一、实验性质实验类别：专业基础课/必修实验类型：综合性计划学时：6实验分组：4人/组二、实验目的将实验3筛选到的转化单菌落进行培养、从培养的大肠杆菌中提取质粒、电泳进行转化子的鉴定。三、实验的基本内容和要求在转化平板上挑取单菌落进行培养，用碱裂解法从大肠杆菌细胞中快速小量提取质粒DNA并进行琼脂糖凝胶电泳，用凝胶成像系统检测。通过对本实验，掌握碱裂解法小量提取纯化质粒的方法，进一步鉴定转化子。四、实验仪器设备及材料超净工作台、低温离心机、恒温摇床、高压灭菌锅、恒温水浴锅、培养皿、涡旋振荡器，电泳仪，制冰机，凝胶成像系统等。五、实验操作要点（一）质粒DNA的提取（碱裂解法）1.细菌的培养和收集：用无菌牙签挑取单菌落接种到10 mL LB液体培养基(含50g/mL Amp)中，37振荡（200rpm）培养约812h至对数生长后期；2.取1.5mL培养液倒入1.5mL eppendorf管中，4下8000rpm离心1 min (两次)；3.弃上清，将管倒置于卫生纸上数min，使液体流尽；4.菌体沉淀重悬浮于100L溶液中(需剧烈振荡)，室温下放置510min；5.加入新配制的溶液200L，盖紧管口，快速温和颠倒eppendorf管数次，以混匀内容物（千万不要剧烈振荡），-20，5min；6.加入150L预冷的溶液，盖紧管口，并倒置离心管，温和振荡10秒，使沉淀混匀，-20，5min，4下12000 rpm离心10min；7.上清液移入干净eppendorf管中，加入等体积的酚：氯仿：异戊醇，混匀，4下12000rpm离心5min；8.上清液移入干净eppendorf管中，加入等体积的氯仿：异戊醇，混匀，4下12000rpm离心5min；8.将水相移入干净eppendorf管中，加入2倍体积的无水乙醇，振荡混匀后置于-20冰箱中30min，然后4下12000rpm离心10min；9.弃上清，将管口敞开倒置于卫生纸上使所有液体流出，加入1mL70乙醇洗沉淀一次，4下12000rpm离心5min；10.吸除上清液，将管倒置于卫生纸上使液体流尽，真空干燥10min或室温干燥；11.将沉淀溶于20L RTE缓冲液（pH8.0，含20g/mLRNaseA）中，储于-20冰箱中保存