一代测序常见问题及解决策略

排序常见问题和解决方案一、PCR常见问题1.假阴性，没有放大带PCR的假阴性结果可以从以下几个方面找到原因：1)模板：模板中有杂蛋白；模板中有Taq酶抑制剂。提取准备模板时损失太大。模板核酸变性是不铁的。2)酶：在酶停用或反应过程中忘记添加酶。3) Mg2浓度：Mg2浓度过高会降低PCR扩增的特异性，浓度过低会影响PCR扩增产量，PCR扩增会失败，没有分条。4)反应条件：退行对PCR扩增至关重要。例如，退行性温度低，变声期时间短，出现假阴性的可能性很高。退火温度过低会导致非特异性放大，降低特定放大效率。退火温度过高会影响底漆和模板的组合，从而降低PCR放大效率。5)目标序列变异：如果目标序列变异或缺失，影响引物和模板特异性的结合，或目标序列的特定片段缺失，导致引物和模板失去互补序列，则PCR扩增不会成功。2.假阳性假阳性：出现的PCR扩增带与目标序列条纹一致，有时更干净，亮度更高。一般原因如下：1)引物设计不合适：选择的扩增序列具有非目的扩增序列和同源，因此PCR扩增过程中扩增的PCR产物是非目的序列。目标序列太短或引物太短，容易产生假阳性。必须重新设计底漆。(2)目标序列或扩增产物的交叉污染：这种污染有两个原因。一是因为整个基因组或大片段的交叉污染导致假阳性。这种假阳性可以通过以下方法解决：操作时要注意目标序列不要用加号枪吸入或离心管突出。二是空气中的小片核酸污染，比目标序列短，但具有一定的同源性。相互结合，与引物互补后，可以扩增PCR产物，诱导假阳性生成，并可以用嵌套PCR方法缓解或去除。出现非特异性放大带PCR放大后出现的条带与预期大小不匹配，大或小，特定放大带和非特异性放大带都出现。出现非特异性条带的原因是引物与目标序列不完全互补，或者引物聚合形成二聚体。第二是Mg2离子浓度过高，退火温度过低，PCR周期次数过多。第三，酶的质量和数量，在某些情况下容易出现在非特异性带，但其他来源的酶往往不会出现，酶过多可能会导致非特异性扩增。该对策是在必要时重新设计底漆。减少酶的数量或更换其他来源的酶。减少底漆的数量，适当增加模板量，减少循环数量。适当提高退火温度或使用2温度点法。发生片状抹布或涂抹带PCR增幅有时会出现涂抹带或片状带或地毯类似带。原因很多是酶太多，酶质量不好，dNTP浓度太高，Mg2浓度太高，退火温度太低，循环次数太高。替代方法是减少酶的数量或更换其他来源的酶。降低dNTP的浓度。适当降低Mg2浓度。增加模板量以减少重复次数。二、第一代测序结果的常见问题及分析原始数据图如下所示：图1分析后无障碍峰值的现有顺序图如下：图2常见问题包括：1.钉子杆图3原因：样品或毛细管内有气泡、灰尘、晶体等固体小粒子反射激光，因此信号高，所有波长(4色)。解决方案：移植时不要生成气泡。使用的毛细管应在拆卸一段时间后重新安装之前清洗。要经常擦灰尘。把样品精制干净。Pcr产品排序中的重叠峰(1)如果单个站点(图4)或两个站点(图5)中的碱缺失，则排序结果代码将移动图4图5原因：碱基的缺失经常出现在PCR产品中，特别是基因组中扩增的PCR片段中，如上图所示，单个部位或两个部位的缺失可能会导致影响碱基读数的测序结果转移码。解决方案：将PCR产物复制到质粒(如t载体)上，选择单克隆测序，或将PCR产物进行页面纯化(至少在琼脂糖电泳后纯化粘合剂)，然后进行测序。或者利用反向引物继续测序，矫正缺失部位，达到测量目的。如果判断PCR片段应该没有缺失的部位，可以改变PCR反应条件，再次放大。2)测序引物碱缺失图6原因是，测序引物与基础缺失(通常是引物的5个端缺失)有些相似，模板基础缺失通常在正常排序序列后出现移位码，如果引物缺失，则从排序开始出现移位码，表面在图形上重叠严重峰。解决策略：重新合成底漆或使用底漆精制页面。克隆排序期间发生峰值重叠图7原因：选定的重组体不是单个克隆体，提供的排序用质粒包含两个或多个插入片段不同的质粒。或发送测序的细菌污染。解决方案：重新选择单克隆群体(用线分离单个群体)，对质粒或细菌注入重新排序。样本中有混合/突变部分图8原因：模板具有混合变异，这意味着模板本身会在这个部位发生突变。或基因组中放大的异质部位。如果模板有混合变异或缺失，则排序图的其他部分通常是单个峰值，在特定点突然出现重叠峰值，如下图中箭头所示。解决方案：建议在矢量重排序中复制DNA片段。5.Poly A/T结构图9图10原因：如图9，10所示，出现Poly A/T结构后，排序酶容易滑过模板，因此Poly A/T结构后的峰值变形导致了移动码现象。解决方法：使用逆向引物对模板进行排序，并测量poly结构，就可以完成模板的全长剥离。G/c特殊结构区域图11原因：序列具有GC特殊结构区域，该区域后信号迅速减弱。上图的下半部分是针对排序反应优化的排序结果，在GC特殊结构后，排序信号有所改善，但与一般排序结果相去甚远。解决方法：对于此类型的样板，通常需要反向排序，然后在此特殊结构区域附近连接两个方向的排序结果以获得整个序列。基因包含重复序列。图12原因：与Poly A/T的结果一样，如果示例包含重复序列，则复制框将滑动，较短的重复序列可能会导致排序结果移动代码。较长的重复序列使信号衰减。解决策略：反向排序有时可以通过重复序列区域(不一定是这样)匹配多个排序结果来获得完整的序列结果。8.背景峰杂化1)模板杂物图13原因：目标片段的条带大小和只有几个碱基的非特异性PCR扩增产物不能用肉眼分辨。但是DNA测序反应敏感客观，可以直接对模板本身的情况做出反应。这个反应背景信号高，不利于碱基的读取。解决方案：更改PCR条件并重新放大。也可以将PCR产物复制到质粒上，进行初步筛选，然后进行单克隆测序。2)引物不纯图14原因：引物不纯，移位码现象在峰值图上显示为模板和其他都是背景峰杂波，但引物在峰值图上没有更规则，通常每个主峰前面都有一个相同的基峰。解决方法：重新合成引物，或在页面精制后排序。9.模板不是单个模板1)细菌是非单克隆图15原因：上图是pGEM-T向量排序的结果，在83部位出现了排序结果bimodal，这是排序结果在向量部分非常精确，进入插入片段后出现bimodal的情况。这是由于接种时未选择单独殖民地，2个以上正常克隆(插入片段相反方向)或正常克隆与空载体混合时，酶或PCR鉴定的异常不易查明，特别是在T-A克隆时经常发生。解决方案：为单殖民地排序重新涂板。需要注意的是，PCR反应或酶鉴定的重新发现只是其克隆只包含插入片段的证据，不足以证明模板的统一性。2) PCR产物不纯图16原因：197bp前出现了测序峰杂波或明显的峰，197bp位置有高a峰，此a峰表示该PCR产品有200bp左右的小块。(注：PCR产品排序以峰值a结束。)，以获取详细信息解决方案：纯化PCR产品并排序。10.回文结构图17原因：部位94 137是后面的信号衰减，导致错误读出的回文结构。解决方法：要完成模板的全长拆分，请使用反向引物指定模板的顺序。11.酒精峰值和染料峰值图18原因：由于Big dye排序反应工具包(BDT)的big dye mix稀释，染料峰值出现过度，精制的酒精在未挥发的情况下出现酒精峰值，通常这些峰值形状出现前200bp的一部分，大部分对排序结果没有影响。解决策略：重新计划反应。排序从一开始就是双峰图19原因：样品本身受到污染，这经常发生在样品是质粒和细菌的情况下。使用通用引物排序时，如果与样品中的多个质粒精确结合，就会发生这种现象，同一位置上可能有两个或多个峰形。样品不是单个模板。这经常发生在样品是PCR产品的情况下。一般来说，PCR样品包含非特异性扩增，分子量接近两个，并有不能通过琼脂糖电泳分离的带，排序时容易发生。样品中有两个引物结合部位，这经常发生在样品中有重复序列的情况下。如果引物完全设计为重复序列，则在重复序列以外的部分发生双模态。解决方案：平面选择单克隆测序；优化PCR系统或复制后的测序；选择特定的底漆。Pcr测序结果显示n值图20原因：这个结果的原因是信号强，高峰型整齐，但是这个排序结果中有很多地方重叠峰，出现n值。这个问题的主要原因可能是这个PCR产品突变体的存在。每个突变部位都有重叠峰，这是因为仪器不能