抗体作为工具

V 免疫技术 抗体作为工具,主要内容,抗体作为研究和诊断的工具 抗原-抗体反应的特点 抗原-抗体反应的基本检测方法 免疫测定技术 单克隆抗体和重组抗体,V1 抗体作为研究和诊断的工具,应用在哪些方面？用已知抗原检测未知抗体；用已知抗体检测未知抗原；定性或定量测定体内各种大分子物质，用于相关疾病的诊断或治疗；用已知的抗体检测一些药物、激素和炎性介质等半抗原物质，用于检测血清中的药物浓度。,V2 抗原-抗体反应的特点,一、抗原抗体反应及效应 抗原抗体反应(antigen-antibody reaction)是指抗原与相应抗体之间所发生的特异性结合反应。可发生于体内也可发生于体外。体内反应可介导吞噬、溶菌、杀菌、中和毒素等作用；体外反应则根据抗原的物理形状、抗体的类型及参与反应的介质不同，可出现凝集反应、沉淀反应、补体参与的反应及中和反应等各种不同的反应类型。因抗体主要存在于血清中，在抗原或抗体的检测中多采用血清作实验，所以体外抗原抗体反应亦称为血清反应。,抗原-抗体结合产生的效应,抗原+抗体,抗原颗粒+特异性抗体，导致颗粒凝集,可溶抗原+特异性抗体，导致晶格形成及沉淀,溶液中的或颗粒上的抗原+特异性抗体，导致补体活化,细胞+抗细胞抗体+补体，导致细胞溶解,抗原颗粒+抗体+补体，增强单核细胞、巨噬细胞、多核细胞的吞噬作用,凝集,沉淀,补体激活,细胞溶解,调理作用,中和作用,毒素、病毒、酶等+特异性抗体，可导致它们失活,二、抗原抗体反应的特点,1 抗原抗体结合的特异性和交叉性 抗原抗体的结合实质上是抗原表位与抗体超变区中抗原结合点之间的结合。 如果两种不同的抗原分子上有一个或多个相同（相似）的抗原表位，或抗原、抗体间构型部分相同，皆可出现交叉反应。,2 抗原抗体结合的可逆性 抗原抗体结合除以空间构型互补外，主要以氢键、静电引力、范德华力和疏水键等分子表面的非共价方式结合，结合后形成的复合物在一定条件下可发生解离，回复抗原抗体的游离状态。解离后的抗原和抗体仍保持原有的性质。 抗原抗体复合物解离度在很大程度上取决于特异性抗体超变区与相应抗原决定簇三维空间构型的互补程度，互补程度越高，分子间距越小，作用力越大，两者结合越牢固，不易解离；反之，则容易发生解离。此外与电解质的pH强度和离子强度有关。,3 抗原抗体结合的比例性与结合物的可见性 等价带：抗原与抗体比例最适合，形成大而多的结合物，此时在反应体系中测不出或有极少游离的抗原或抗体。 抗体过剩带（前带）：细胞等颗粒性抗原，与 抗体反应时出现的现象。 抗原过剩带（后带）：小分子可溶性抗原因其表面积大而容易出现的现象。,4 抗原抗体反应的阶段性,两个阶段,抗原抗体的特异性结合 几秒到几分钟,可见反应阶段 时间长，受各种因素影响,三 、抗原抗体反应的主要影响因素,1 抗原抗体的浓度、比例 对抗原抗体反应影响最大，是决定性因素。2 电解质 抗原与抗体特异性结合后，其亲水性减弱，分子表面所带的电荷易受电解质影响而失去，复合物间的排斥力下降，导致第一阶段已形成的可溶性结合物能进一步联结，出现明显的凝集或沉淀现象。实验中常用0.85的NaCl溶液作为稀释液，以提供适当浓度的电解质。,3 温度 适当的温度可增加抗原与抗体分子碰撞的机会，加速结合物 体积的增大，一般而言温度越高，形成可见反应的速度越快，但过高则会使抗原或抗体变性失活，影响实验结果。一般在37下进行实验，但也有些抗原抗体在4下进行反应较好。4 酸碱度 pH过高或过低都将直接影响抗原或抗体的理化性质。 例如，当pH降至3.0左右时，因接近细菌抗原的等电点，细菌表面蛋白或其他基团所带的电荷消失，其相互间的排斥力丧失而导致非特异性酸凝集，影响实验的可靠性。,V3 抗原抗体反应的基本检测方法,一 、沉淀反应(precipitation） 是指可溶性抗原与相应抗体在合适的电解质存在下，出现肉眼可见的沉淀现象。参与反应的抗原称沉淀原，抗体称沉淀素。,沉淀反应,单相琼脂扩散(simple agar diffusion),火箭电泳(rocket electrophoresis),双向琼脂扩散(double agar diffusion),对流免疫电泳(counter immunoelectrophoresis),1 单相琼脂扩散,将特异性抗体与融化的琼脂混合均匀，使抗体均匀分布于琼脂，然后浇制成琼脂板，再按一定要求打孔并加入抗原，使抗原向孔周围自由扩散，与板中的抗体形成沉淀圈。本法为定量试验，沉淀圈的直径与抗原浓度成正比。常用于血清中各类免疫球蛋白、AFP等的定量测定。,2 火箭电泳 建立在单相琼脂扩散的基础上，将琼脂板至于电场中，使抗原由负极向正极作定向扩散，与板中的抗体结合形成锥形沉淀峰，峰的高度与抗原浓度成正比。在电场作用下，此方法时间短，可快速测定抗原含量。如在标本中加入同位素标记的抗原，可做放射免疫自显影。,3 双向琼脂扩散 先制备琼脂板，再按要求打孔并分别加入抗原和抗体，使两者同时在琼脂板上扩散，若两者对应且比例合适，则在抗原和抗体两孔之间形成白色沉淀线。 一对相应的抗原抗体只形成一条沉淀线，因此可根据沉淀线的数目推断待测抗原液中有多少种抗原成分；根据沉淀线的吻合、相切或交叉形状，可鉴定两种抗原是完全相同、部分相同还是完全不同。,4 对流免疫电泳 建立在双向琼脂扩散的基础上，抗原孔在负极，抗体孔在正极，在运动过程中形成对流，并在比例适宜处形成白色沉淀线。,此外还有免疫电泳、交叉电泳、免疫选择电泳、免疫固定电泳，最近建立的散射比浊、速率散射比浊等各种方法。,二、 凝集反应(agglutination),指颗粒性抗原(细菌、细胞等)与相应的抗体，或可溶性抗原(亦可用抗体)吸附于与免疫无关的载体形成致敏颗粒(免疫微球)与相应的抗体(或抗原)，在有适量电解质存在下，形成肉眼可见的凝集小块。1 直接凝集反应(direct agglutination)：颗粒性抗原与相应抗体直接结合所呈现的凝集现象。2 间接凝集反应(indirect passive agglutination)：可溶性抗原或抗体吸附于与免疫无关的微球载体上，形成致敏颗粒，与相应的抗体或抗原在电解质存在的条件下进行反应，产生凝集。3 间接凝集抑制试验(indirect agglutination inhibition test)：将可溶性抗原与相应抗体预先混合并充分作用，再加入抗原致敏的载体，此时因抗体已被抗原结合，阻断了抗体与致敏载体上的抗原结合，不再出现凝集现象。,V4 免疫测定技术,酶联免疫吸附法(ELISA)放射免疫测定(RIA)免疫荧光技术(Immunofluorescence)流式细胞术(Flow Cytometry)免疫印迹(Immunoblotting)亲和色谱（Affinity Chromatography),一、酶联免疫吸附法,将抗原-抗体反应的特异性与酶催化作用的高效性相结合，借助于酶作用于底物的显色反应判定结果。应用酶标仪测定光密度（OD）值反应抗原含量。 1 双抗体加心法 用于测定抗原。利用连接于固相载体上的抗体和酶标抗体分别与样品中被检测抗原分子上两个抗原决定簇结合，形成固相抗体-抗原-酶标抗体免疫复合物。测定复合物中的酶作用于加入的底物后生成的有色物质量(OD值)，用酶标仪即可确定待测抗原含量。,2 间接法 间接法是检测抗体最常用的方法，其原理为利用酶标 记的抗体以检测已与固相结合的受检抗体，故称为间接法。,3 竞争法,常用于抗原和半抗原的定量测定，也可用于抗体的测定。 例：抗原测定,已知抗体吸附于固相载体,测定孔,对照孔,加入待检样本+一定量已知酶标抗原两者竞争性的结合已知抗体,加入一定量的酶标抗原,加底物显色测定,二、放射免疫测定,1 放射免疫测定 以放射性核素标记的抗原和检品中未标记抗原与固定量特异性抗体竞争结合，或进行竞争性抑制反应。,是以放射性核素作为示踪剂的标记免疫测定方法，其特点是将核素分析的灵敏度与抗原抗体反应的特异性相结合。,2 免疫放射测定 是将待测抗原与过量标记抗体直接反应，然后加入固相的抗原免疫吸附剂与游离的标记抗体结合。经离心去除沉淀物，测定上清液放射性强度，从而推算出检品中待测抗原含量。,三、免疫荧光技术,其实质是荧光素标记的抗体（抗原）与抗原（抗体）的反应，用于检测各类病原体。,应用特异性荧光抗体直接检查标本中的相应抗原。,以特异性抗体（或待测抗体）为第一抗体，以荧光素标记的抗球蛋白抗体（标记的抗体）为第二抗体，用于检测抗体或抗原。,此法是在间接法的第一步抗原抗体反应加入补体，使之与抗原抗体复合物结合；再用荧光素标记的抗补体抗体进行示踪。,四、 流式细胞术 流式细胞术是将免疫荧光技术应用于流式细胞仪，对单个细胞表面标志（抗原或受体）进行快速、精确分析和自动检测，并可对不同类型细胞进行分选和收集。还可对同一细胞的多种参数（如DNA、RNA、蛋白质和细胞体积等）进行多信息分析。与传统的荧光镜检查相比，具有速度快，精确高，准确性好等优点，故成为当代生命科学研究领域中被广泛应用的一项新技术。,工作原理：首先样品经过与多种荧光素标记的抗体反应，因荧光素发射光谱的波长不同，信号能同时被接收，故能同时接收细胞表面多个膜分子表达及其水平。此外，借助光电效应，微滴通过电场是出现不同的偏向，可分类收集所需细胞。,五、免疫印迹 免疫印迹又称蛋白质印迹，是根据抗原抗体的特异性结合检测复杂样品中的某种蛋白的方法。该法是在凝胶电泳和固相免疫测定技术基础上发展起来的一种新的免疫生化技术。由于免疫印迹具有 SDS-PAGE 的高分辨力和固相免疫测定的高特异性和敏感性，现已成为蛋白分析的一种常规技术。免疫印迹常用于鉴定某种蛋白，并能对蛋白进行定性和半定量分析。,六、亲和色谱,在生物分子中有些分子的特定结构部位能够同其他分子相互识别并结合，如酶与底物的识别结合、受体与配体的识别结合、抗体与抗原的识别结合，这种结合既是特异的，又是可逆的，改变条件可以使这种结合解除。生物分子间的这种结合能力称为亲和力。亲和层析就是根据这样的原理设计的蛋白质分离纯化方法。 由于抗原抗体的结合部形成共价键，与不溶性基质偶联的抗体可特异性的结合期抗原，把它从其它分子的混合物中移出。洗涤后，去掉所有未结合的分子，在打破保持抗原对抗体的可逆键的低pH或高离子强度下，将抗原洗脱下来。由于通常使用这一方法不会破坏抗原或抗体，所以有可能一步就获得比较纯的抗原。同理，抗原也是如此。,三个要素：介质：具有活化基团间隔臂连接介质与配体的分子配体：具有识别能力反配体或分离物：与配体进行可逆结合,V5 单克隆抗体与重组抗体,一、单克隆抗体 是由一个克隆B细胞产生的、只作用于单一抗原表位的高度特异性抗体。,单抗的特点：1 高度的均质性：始于一个B细胞的克隆系2 高度的特异性：针对单个抗原决定簇3 来源稳定，产量大,主要步骤,抗原的制备免疫动物免疫细胞、骨髓瘤细胞的制备细胞融合（核心步骤 ）杂交瘤细胞的选择培养杂交瘤细胞的筛选杂交瘤细胞的克隆单克隆抗体的鉴定单克隆抗体的大量制备,应用：A 作为工具B 诊断：单克隆抗体具有高度的特异性与灵敏性，可以广泛地由于临床医学的疾病诊断，以提高疾病诊断的准确性。C 预防：利用单克隆抗体技术可以生产各种免疫疫苗，这不仅能大大降低生产成本，同时也增加了疫苗的安全性。D 治疗：单克隆抗体还有可能用于某些肿瘤的治疗。,二、多克隆抗体,用一种包含多种抗原决定簇的抗原免疫动物，可刺激机体多个B细胞克隆产生针对多种抗原表位的不同抗体。所获得免疫血清实际上是含有多种抗体的混合物，即多克隆抗体。,产生示意图,多克隆抗体的特点,多克隆抗体,优势：作用全面来源广泛制备容易,缺点：特异性不高易出现交叉反应应用受限,三、mAb的人源化和嵌合体,1 人源化鼠的抗体 鼠的抗体可被修饰成遗传上更接近人的抗体。特别是鼠的IgG重链和鼠的轻链的恒定区在DNA水平上可以用人IgG1重链和轻链的恒定区所取代，以创建一个只有可变区（V）来源于鼠类的嵌合抗体。这明显地降低但并没有消除此抗体的免疫原性。 另一种方法包括测定小鼠抗体重链和轻链的V区序列，然后将这些链的高变区的DNA序列插入人的IgG重链和轻链基因中。这样产生的抗体95是人的，仅结合区是源于鼠的。,嵌合抗体,人源化抗体,2 直接制备人的mAb 通过人的B细胞和骨髓瘤细胞融合，已经制成了人的抗体，虽然这曾是十分困难的，并且通常在融合前需要用EB病毒感染以无限增殖B细胞。这种方法由于使用病毒而不理想，产生的mAb的特异性是有限的，抗体的产量也很少