食品生物技术2012.ppt

食品生物技术FoodBiotechnology,2012年10月,食品生物技术,主要内容（共八章）：绪论基因工程及其在食品工业中的应用酶工程及其在食品工业中的应用发酵工程及其在食品工业中的应用细胞工程及其在食品工业中的应用生物技术在饮料工业中的应用生物传感器及其在食品工业中的应用生物技术在食品工业废水处理中的应用,食品生物技术,第一章绪论第一节食品生物技术研究的内容生物工程及其研究内容1917年匈牙利工程师KarlEreky提出（甜菜养猪，利用生物将原料转变为产品）生物工程：生物工程是一门应用生物科学和工程学原理，来加工生物材料或利用微生物、动物植物体作为反应器及其制备物（细胞或细胞器或某些组成成分如酶）来加工原料以提供产品为社会服务的综合性科学技术。BiotechnologyorBioengineering,生物技术的发展历史,生物技术是一个既古老又年轻的学科。古老：具有很悠久的历史：公元前6000年，古代萨马人和巴比伦人已经开始喝啤酒；公元前4000年埃及人烤制发酵面包；创世纪一书问世时，葡萄酒就闻名于近东。发酵乳制品的生产（乳酪、酸奶等）和各种东方食品（如酱油）的生产都具有古老的渊源。日本的香菇的栽培可以追溯到几百年前，伞菇的栽培大约有300年的历史。5000年前我国的酿酒技术已相当精湛。年轻：现代生物技术开始于20世纪70年代，即基因工程诞生之后。,生物技术的发展历史,两个发展阶段：传统生物工程和现代生物工程前者主要通过微生物的初级发酵来生产商品，后者以DNA重组技术出现为代表。三阶段观点：原始生物工程（第一代生物工程），非纯种微生物发酵工艺为标记；近代生物工程（第二代生物工程），采用纯种微生物的发酵工艺；现代生物工程（第三代生物工程），以基因工程诞生为标志。,生物技术的发展历史,1857年Pasteur发现发酵过程是由微生物作用的结果，并因此成为当之无愧的生物工程之父。人类利用发酵生产是在19世纪，主要产品有乳酸、酒精、面包酵母、柠檬酸和蛋白质及酶等初级产物。20世纪40年代，以获取细菌的次生代谢物抗生素为主要特征的抗生素工业成为生物工程的支柱产业。50年代氨基酸发酵工业成为生物工程的一个重要组成部分。60年代又增加了酶制剂工业这一新成员。,生物技术的发展历史,传统生物技术的三个重要步骤：第一步：上游处理过程，是指对粗材料进行加工，作为微生物的营养和能量来源；第二步：发酵和转化，即在大的生物反应器（100L）大量生长微生物来生产某种产品，如抗生素、氨基酸或蛋白质等；第三步：下游处理，对所需的目的产物的分离纯化。传统生物技术研究主要目标：最大限度提高这三个步骤的整体效率，同时寻找可以制备食品和食品添加剂和药物的微生物。,生物技术的发展历史,研究内容：生物转化环节的优化：菌种的选育和改良，包括化学突变、诱变或紫外线照射来产生突变体，通过选择来改良菌株，提高产量（例如抗生素的大量生产）。生物反应器的设计、发酵过程的检测和反应体系的检测技术下游产品的分离纯化技术局限性：提高产量的幅度有限（突变株某一组分合成太多影响其它组分的合成进而影响微生物在大规模发酵过程的生长）；诱变和选择方法过程烦琐，耗时长，费用极高需筛选和检测大量的克隆；只能提高已有的遗传性质不能赋予其他新的遗传性质。传统的生物技术仅仅局限在化学工程和微生物工程的领域。DNA重组技术的出现和发展引发的根本性的改变，即现代生物技术的时代的到来。,DNA重组技术的出现标志着现代生物技术的开始；1953年，Watson和Crick发现了DNA的双螺旋结构，奠定了现代分子生物学的基础，给整个生物学乃至人类社会带来了一场革命。1973年HerberBoyer和StanleyCohen完成人类历史第一次有目的的基因重组尝试（pSC101，EcoRI,T4-DNAligase）；并据此提出了“基因克隆”的策略。,现代生物技术内容,生物转化的环节更为有效，不仅可以分离得到高产菌株，还可以人工制造高产菌株；原核生物化和真核生物都可以表达大量的外源蛋白（胰岛素、病原抗原等），动植物也可以作为天然的生物反应器；大大简化新药的开发和监测系统；,现代生物技术内容,基因工程（GeneEngineering）细胞工程（CellEngineering）酶工程（EnzymeEngineering）发酵工程（FermentationEngineering）蛋白质工程（ProteinEngineering）,现代生物技术内容,基因工程：把生物体的遗传物质（通常为DNA）分离出来在体外切割、拼接和重组。然后把重组DNA导入宿主细胞或个体，从而改变它们的遗传性质或使新的遗传信息大量表达以获取基因产物。也称DNA重组技术。细胞工程：指以细胞为单位，在体外进行培养和繁殖或使细胞某些生物学特性按人们的意志发生改变，从而改良生物品种和创新品种，加快繁殖个体或获得某种有用物质的过程。细胞工程应包括动植物细胞的体外培养、细胞融合技术（细胞杂交技术）、核移植技术等,现代生物技术内容,酶工程：利用酶、细胞器或细胞特有的催化功能，或对酶进行修饰改造，并借助生物反应器和工艺过程来生产人类所需产品的技术。包括酶的固定化技术、细胞固定化技术、酶的修饰改造技术及酶反应器的设计等。发酵工程：利用微生物生长速度快、生长条件简单以及代谢过程特殊的特点，在合适的条件下，通过现代化工程技术手段，由微生物（或动植物细胞）的某种特定功能生产人类所需的产品。过去也称微生物工程。,现代生物技术内容,蛋白质工程：指在基因工程的基础上，结合蛋白质结晶学、计算机辅助设计和蛋白质化学等学科的基础知识，通过对基因的人工定向改造等手段，从而对蛋白质进行修饰、改造、拼接以产生能满足人类需要的新型蛋白质。基因工程和细胞工程特别是基因工程现代生物技术的核心，它们给传统的酶工程和发酵工程注入了新的活力。,现代生物技术内容,基因工程,微生物,动植物个体或细胞,工程菌,蛋白质或酶,发酵过程,蛋白质工程或酶工程,细胞工程,优良的动植物品系,产品,现代生物技术内容之间的关系,现代生物技术内容,基因工程是基础，而所以基因工程的结果都要通过生物体本身或其细胞（生命活动的基本结构和功能单位）内的酶（或发酵）作用而表现出来。因此，细胞工程是最基本的生物工程技术。蛋白质工程与基因工程关系密不可分。不同的是基因工程操作单位是整个基因，而蛋白质工程的操作是一个或一些碱基。,现代生物技术与其它学科的关系,现代生物技术是生物学与工程学原理综合交叉的边缘学科，亦为知识和技术密集型学科。本学科既是应用生命活动的基本原理，则必需掌握生物体结构、功能、代谢活动及其规律等有关知识，因此与细胞生物学、分子遗传学、微生物学、生理学、生物化学、生物物理学，甚至与物理学、化学及数学等基础学科均有密切关系。同时工程化要求掌握生物反应器的构造原理、生物反应工程原理、物质传递规律、设备运转及其控制条件等基本知识，故与化学工程原理、发酵工程、生物化学工程、电子工程、材料科学、计算机科学及信息科学等密切相关。,现代生物技术的特点,高效和经济清洁、低耗和可持续发展可遗传、易扩散与自主扩展对人类伦理和人性尊严有直接影响（如克隆人.）,现代生物技术内容,根据研究领域和内容：农业生物工程食品生物工程医药生物工程海洋生物工程.,现代生物技术的发展趋势,基因操作技术日新月异，不断完善，从发明到应用时间不断缩短；基因工程药物和疫苗研发（R延缓疏果成熟，提高抗病抗逆能力及加工性能等.二、改良微生物菌种性能转基因改良的面包酵母，啤酒酵母和转基因的大肠杆菌，以及用于生产食品添加剂和加工助剂的改良菌株三、应用于酶制剂的生产重组DNA技术生产小牛凝乳酶；耐热的-淀粉酶；糖化酶基因在酵母中表达和SOD在酵母和大肠杆菌中的高效表达等四、改良食品加工工艺克隆基因降低大麦中的醇溶蛋白，利于啤酒的生产；提高牛奶的热稳定性。五、生产保健品的有效成分鹿茸、牛黄的人工培养和人参细胞的培养；人的血红素基因转到猪中，用猪生产人血的替代品等。,食品生物技术第二章基因工程及其在食品工业中应用,第七节蛋白质工程一、基因修饰改造蛋白质结构定位突变（P35和图2-3）盒式突变二、蛋白质工程的应用溶菌酶稳定性的改造，葡萄糖异构酶最适pH的改变；单克隆抗体的“人类化”,食品生物技术第二章基因工程及其在食品工业中应用,第八节基因工程食品卫生安全管理规范美国提供给消费者基因工程食品有三种：动物用药、完整的食物和食品添加剂。英国基因工程食品四类标准：采用基因工程菌生产的与传统食品质量和成分相同；食品内容含有与自身同种基因的基因工程菌生产的食品；食品中含有别的基因工程菌的成分；食品含有别的基因工程菌，而这种菌含有别的物种基因。*前两种无需标示，后两类则需要标示出来。,食品生物技术第三章酶工程及其在食品工业中应用,酶是一类生物催化剂，其催化活性是由其特定的空间结构决定的。酶分子具有活性中心（对催化作用特别重要的极小的空间和区域，往往由几个氨基酸组成），包括结合部位和催化部位。前者处于底物结合部位，决定酶的专一性，后者决定酶的催化类型和性质。具有调节作用的酶还有“别构部位”。这是酶的抑制剂或活化剂的结合部位。酶作用具有高度专一性、催化效率高、活性调节控制机制复杂、在常温常压和生理条件下行使功能。,食品生物技术第三章酶工程及其在食品工业中应用,酶工程：应用酶的特异的催化功能并通过工程化为人类生产有用产品和提供有益服务的技术。从动植物体及微生物发酵物中制取的酶称为第一代酶(已形成一定的产业规模)。固定化酶称为第二代酶（已得到推广应用）；固定化生长态细胞和多酶体系及固定化辅酶称为第三代酶（已实现工业化）。后二者称为现代酶工程。酶工程是研究酶的生成和应用的一门技术性学科，包括酶制剂的制备、酶的固定化、酶的修饰改造及酶反应器等方面的内容。,食品生物技术第三章酶工程及其在食品工业中应用,酶的来源：生物界有3000多种酶，来源有动植物组织（如来自动物的胰蛋白酶和来自植物的木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶），大多数来自微生物及其发酵液（葡萄糖异构酶、枯草杆菌蛋白酶等）。微生物包括细菌、真菌、放线菌、霉菌、酵母等。,食品生物技术第三章酶工程及其在食品工业中应用,固定化酶及其特性固定化酶：限定或位于特定空间的酶，又称固着酶（Immobilizedenzyme）。固定化酶属于修饰酶（与天然酶对应），修饰酶还包括蛋白质工程技术改良的酶。固定化酶有包埋型及结合型（酶结合在载体上）。包埋型有凝胶包埋及微囊化包埋两类；结合型又分为吸附与共价两种。,固定化酶,包埋型,结合型,凝胶包埋,微囊化包埋,吸附结合型,共价结合型,食品生物技术第三章酶工程及其在食品工业中应用,固定化酶的优点（可溶性的酶变为不溶于水的酶）：稳定性高于天然酶反应后酶与底物易于分开，并可长期反复利用反应液中无残留酶，产物易于纯化，产品质量高可实现转化反应连续化和管道化和自动控制生产酶的利用率高，降低了生产成本转化过程基本上无三废排出（被称为“无公害酶”）,食品生物技术第三章酶工程及其在食品工业中应用,固定化细胞及其特性固定化细胞：被限制或定位于特定空间位置的细胞（与固定化酶一起统称固定化生物催化剂）。此技术已扩展至动植物细胞甚至线粒体和叶绿体等细胞器的固定化。其应用比固定化酶更为普遍。固定化细胞的特点：无需进行酶的分离纯化，减少投资；细胞保持原初生命状态，固定化过程酶回收率高；细胞内酶较固定化酶稳定性更高；细胞内辅助因子可以自动再生；细胞本身含多酶体系，可催化一系列反应；抗污染能力强。,食品生物技术第三章酶工程及其在食品工业中应用,细胞固定化方法：载体结合法：吸附法和共价结合法包埋法（凝胶或微囊）交联法（crosslinking）选择性热变性（在适当温度下使细胞膜蛋白变性但不使酶变性而使酶固定在细胞内）,食品生物技术第三章酶工程及其在食品工业中应用,酶法应用于纤维素的水解纤维素大量广泛存在，加强综合利用和提高利用效率对净化环境和开辟新能源等意义重大。纤维素酶是降解纤维素成葡萄糖的一组酶的总称（不是一种单一纯酶）即包括多种水解酶，是一种复合酶。一般分为三类：葡萄糖内切酶（endo-1,4-D-glucanase,EG），产物为非还原末端的小分子纤维素葡萄糖外切酶（exo-1,4-D-glucanase）,又叫纤维二糖水解酶（cellobiosehydrolase，CBH），产物纤维二糖分子。-葡萄糖苷酶（-glucosidase，BG）底物为纤维二糖和纤维寡糖，产物为葡萄糖。产酶菌种：细菌、放线菌、真菌和酵母,食品生物技术第三章酶工程及其在食品工业中应用,测定纤维素酶活力的方法：滤纸崩溃法，棉花糖化力，CMC糖化力（以还原糖表示），CMC液化力（以粘度表示）和滤纸糖化力等。其中，CMC糖化力主要代表外切-1,4-葡萄糖酶的活力和内切酶活力的总和；CMC液化力主要代表内切-1,4-葡萄糖酶活力；滤纸糖化力代表“纤维素糖化”酶活力或总纤维素的酶活力。*CMC（carboxylmethylcellulose）:羧甲基纤维素*HEC(hydroxyethylcellulose):羟乙基纤维素,食品生物技术第三章酶工程及其在食品工业中应用,影响纤维素酶作用的因素：底物、酶组成、pH、温度和抑制剂和活化剂。纤维素酶在食品工业中的应用P47481.果汁生产：促进果汁提取与澄清。果皮渣酶解转化为可溶性糖和降解为短链低聚糖即膳食纤维。2.香料生产：利于香料在提取液扩散与分配，增加得率和产量。3.果蔬生产：提高可消化性改进口感和脱水蔬菜的烧煮性和复原性。4.种子蛋白利用：增加大豆或豆饼水溶性蛋白质的得率，缩短时间，提高质量。5.速溶茶生产：提高得率保持原来的色、香、味，缩短提取时间，提高水溶性较差的茶单宁和咖啡因的提取率。6.可发酵糖的生产：糖化酶处理产生可供微生物发酵利用的碳源，来生产酒精和单细胞蛋白。对利用丰富的纤维素资源意义重大。7.琼脂生产：提高得率，简化工艺，避免琼脂的分解。,食品生物技术第三章酶工程及其在食品工业中应用,纤维素酶在发酵工业中应用的两种方式：一种先糖化再经微生物发酵生产；另一种是在加入纤维素酶的同时接种用于微生物发酵。后一种解除了第一种方式中降解产物（如葡萄糖）对纤维素酶的抑制作用，提高了产量。主要应用于酱油酿造、制酒工业和纤维素废渣转化利用。酶法应用于淀粉糖类的生产P4862酶法生产新型低聚糖酶法应用于干酪产品生产酶法应用于环壮糊精的生产其它酶在食品加工中的应用,食品生物技术第三章酶工程及其在食品工业中应用,第二节：酶法应用于淀粉糖类的生产-淀粉酶：底物淀粉，作用位置底物内部随机-1,4糖苷键，产物为分子量不等的糊精和少量低聚糖和麦芽糖和葡萄糖。不水解支链淀粉的-1,6糖苷键和靠近分枝点-1,6糖苷键外的-1,4糖苷键。工业上称为液化型淀粉酶。随淀粉分子分子量变小，水解速度变慢，底物分子量越小，水解速度越慢。钙离子对保持酶的最大活性与稳定性和适当的构像很重要。来源：动物、植物和微生物，工业-淀粉酶主要来自细菌和曲霉。细菌芽孢杆菌，特别是耐热性的-淀粉酶。,食品生物技术第三章酶工程及其在食品工业中应用,-淀粉酶：底物为淀粉，位点为非还原端，产物两个葡萄糖单位并把原来的构型转化为构型。特点只水解-1,4糖苷键，不水解-1,6糖苷键，因此水解支链淀粉不完全，产生较大的极限糊精和生成5060的麦芽糖。广泛存在于植物和微生物中，生成-淀粉酶的微生物主要有芽孢杆菌、假单胞杆菌、放线菌等。工业上主要以植物为主生产麦芽糖。,食品生物技术第三章酶工程及其在食品工业中应用,葡萄糖淀粉酶：作用于淀粉的非还原端依次水解一个葡萄糖分子并把构型转变为构型。可以水解-1,4糖苷键、-1,6糖苷键和-1,3糖苷键脱枝酶：作用于支链淀粉、糖原的分枝点的-1,6糖苷键。与淀粉酶一起来制造麦芽糖可使麦芽糖的得率从5060提高到90；与糖化酶一起可将淀粉转化为葡萄糖的得率提高到90以上。,食品生物技术第三章酶工程及其在食品工业中应用,果糖糖浆的生产分为淀粉液化、糖化和葡萄糖异构化几个工序。超高麦芽糖的生产也包括液化、糖化阶段，其中糖化可以利用糖化型淀粉酶糖化，也可以利用淀粉酶和脱枝酶协同糖化。麦芽糖的精制的方法有吸附分离法（活性炭柱精制法和阴离子交换树脂法）、有机溶剂沉淀法、膜分离法（超滤、反渗透）、结晶法等方法。,食品生物技术第四章发酵工程及其在食品工业中应用,发酵工程：利用微生物生长速度快、生长条件简单以及代谢过程特殊的特点，在合适的条件下，通过现代化工程技术手段和微生物（或动植物细胞）的某种特定功能生产人类所需的产品。过去也称微生物工程（由于以培养微生物为主）。发酵工程是生物技术的重要组成部分，是生物技术产业化的重要环节，它将微生物学、生物化学和化学工程的基本原理有机地结合起来，是一门利用微生物的生长和代谢来生产各种有用物质的工程技术。发酵技术有着悠久的历史。发酵（fermentation），来自拉丁语发泡（fervere），是指酵母作用于果汁或发芽谷物产生CO2的现象。巴斯德研究酒精发酵的生理意义，认为发酵是酵母在无氧状态下的呼吸过程。生物化学上的定义为“微生物在无氧状态的呼吸过程”。目前，把利用微生物在有氧或无氧条件下的生命活动来准备微生物体或其代谢产物的过程统称为发酵。,食品生物技术第四章发酵工程及其在食品工业中应用,从开始的酿酒、制酱、制奶酪，到40年代抗生素工业的兴起，再到在传统发酵的基础上结合了现代DNA重组、细胞融合、分子修饰改造等新技术的现代发酵技术。优点：投资省，见效快、污染小、外源目的基因在微生物菌体中高效表达等。发酵产品的产量与初期相比，至少增加了几十倍。发酵生产的抗生素品种高达200多个，发达国家发酵工业的产值占国民生产总值的5。在医药行业占20。涉及到许多领域。发酵过程主要内容包括生产菌株的选育，发酵条件的优化与控制，反应器的设计及产品的分离、提取与精制等。,食品生物技术第四章发酵工程及其在食品工业中应用,目前已知具有生产价值的发酵类型有以下五种：,微生物菌体的发酵，比较传统的菌体发酵工业，有用于面包制作的酵母发酵及用于人类或动物食品的微生物菌体蛋白（即单细胞蛋白，SCP）发酵两种类型。新的菌体发酵可用来生产一些真菌，如香菇类、依赖虫蛹而生存的冬虫夏草菌、与天麻共生的密环菌以及从多孔菌科的茯苓菌获得的名贵中药茯苓和担子菌的灵芝等药用菌。有的微生物菌体还可用作生物防治剂，如苏云杆菌。微生物酶发酵，目前工业上应用的酶大多数来自微生物发酵。因为微生物具有种类多、产酶的品质多、生产容易和成本低等优点。如微生物生产的淀粉酶和糖化酶用于生产葡萄糖。微生物代谢产物发酵，包括初级代谢产物（在菌体对数生长期的产物，如氨基酸、核酸、蛋白质、糖类等（这些在食品工业具有相当的重要性，分别形成不同的发酵产业）和次级代谢产物（在菌体生长的静止期合成，是一些具有特定功能的产物如抗生素、生物碱、细菌毒素、植物生长因子等）。前者是菌体生长繁殖所必须的。后者和菌体的生长繁殖无明显关系。特别是抗生素的发酵已成为发酵工业的重要支柱。微生物的转化发酵，利用微生物细胞的一种或多种酶，把一种化合物转变为结构相关的更有经济价值的产物。如菌体将乙醇转化为醋酸的发酵。生物工程细胞的发酵，指利用生物工程技术所获得的细胞进行培养的新型发酵，如基因工程菌生产胰岛素、干扰素、青霉素酰化酶等，杂交瘤细胞生产单克隆抗体等,食品生物技术第四章发酵工程及其在食品工业中应用,菌种的筛选的标准即菌种需具备的特性：1，稳定而高产的遗传特性；2，抗噬菌体能力强；3，发酵过程泡沫少；4，需氧量低；5，底物转化率高；6，对培养物和前提耐受力强；7，营养特性和发酵过程可用廉价原料为培养基；8，最适温度高；9，既具有高的遗传稳定性又要有基因操作可修饰性；10，产物易于从发酵液中回收。,食品生物技术第四章发酵工程及其在食品工业中应用,微生物的发酵过程：根据微生物的种类不同（好氧、厌氧、兼性厌氧），可分为好氧性发酵和厌氧性发酵两大类。好氧性发酵，在发酵过程中需要不断地加入一定量的无菌空气，如利用黑曲菌进行柠檬酸的发酵、利用棒状杆菌进行的谷氨酸的发酵和黄单胞菌进行多糖的发酵等等。厌氧性发酵，不需要供给空气，如乳酸菌引起的乳酸发酵、梭状芽孢杆菌引起的丙酮、丁醇发酵等，兼性厌氧，酵母菌是兼性厌氧微生物，在缺氧条件下厌氧性发酵积累酒精，而在有氧条件下则进行好氧性发酵，大量繁殖菌体细胞。,食品生物技术第四章发酵工程及其在食品工业中应用,按照设备来分：敞口发酵、密闭发酵、浅盘发酵和深层发酵。敞口发酵，设备要求简单，用于繁殖快并进行好氧性发酵的类型，如酵母的生产。由于酵母的迅速大量的生产抑制了其它杂菌的生长。密闭发酵，设备要求严格，工艺复杂。浅盘发酵，一薄层培养液，接种后在液体上面形成一层菌膜。用于繁殖快好氧性微生物的培养。深层发酵，在液体培养基内部（不仅仅在表面）进行微生物的培养。,食品生物技术第四章发酵工程及其在食品工业中应用,深层发酵具有很多优点：,液体悬浮状态是微生物最适的生长环境；液体中菌体及营养物、产物易于扩散，发酵在均质或拟均质的条件下进行，便于控制，易于扩大生产规模；液体输送方便，易于机械化操作；厂房面积小，生产效率高。易于自动化控制，产品质量稳定；产品易于提取、精制等。,食品生物技术第四章发酵工程及其在食品工业中应用,发酵工业常用的微生物：细菌（枯草芽孢杆菌、乳酸杆菌、醋酸杆菌、短杆菌，用于淀粉酶、乳酸、醋酸、氨基酸和肌苷酸等的生产）放线菌（主要来自其下的链霉菌属、小单胞菌属和诺卡氏菌属。抗生素的60是由放线菌生产的）酵母菌（啤酒酵母、假丝酵母、类酵母，用于酿酒、制造面包、生产脂肪酶，可食用、药用和饲料用的酵母菌蛋白）霉菌（藻状菌纲的根酶、毛霉、梨头霉，子囊菌纲的红曲霉，半知菌类的曲霉、青霉等，用于酶制剂、抗生素、有机酸及甾体激素的生产）其它微生物（担子菌即通常所说的菇类微生物，如香菇多糖，灵芝多糖类物质都有抗癌作用；藻类，如螺旋藻）,食品生物技术第四章发酵工程及其在食品工业中应用,培养基的种类和组成培养基的种类：孢子培养基，供制备孢子用，要求：形成大量优质孢子但不能引起菌株变异。基质浓度特别是有机氮源要低些，无机盐的浓度要适当菌种（种子）培养基，供孢子发芽和菌体生长繁殖用，营养成分比较丰富完整易吸收，氮源和维生素含量应略高些。发酵培养基，供菌体生长繁殖和合成大量代谢物，要求营养成分丰富完整，浓度和粘度适中。,食品生物技术第四章发酵工程及其在食品工业中应用,培养基的组成：碳源：单糖（如葡萄糖、果糖）、双糖（如蔗糖、麦芽糖）和缓慢利用的淀粉和纤维素等。其中，玉米淀粉及其水解液常用于抗生素、氨基酸、核苷酸、酶制剂等的发酵；马铃薯、小麦、燕麦淀粉等用于有机酸、醇的发酵生产。有些有机酸、醇作在单细胞蛋白、氨基酸、维生素、麦角碱和某些抗生素的发酵碳源。有些石油产品作为微生物发酵的主要原料。氮源：有机氮（黄豆饼、棉子饼、蛋白胨、酵母粉、鱼粉等）和无机氮源（硫酸铵、氯化铵和硝酸铵等）无机盐和微量元素：功能为构成原生质体的成分（如磷硫等）、作为酶的组成成分和维持酶的活性（镁、铁、锰、锌钴等）、调节细胞的渗透压和影响细胞膜的透性（氯化钠、氯化钾等）和参与产物的生物合成等。微量因素一般有0.1ppm浓度就可以满足要求。生长因子：维生素、氨基酸、嘌呤和嘧啶的衍生物等。水：深井水、自来水和地表水产物形成的诱导物、前体和促进剂：许多胞外酶的合成需要适当的诱导物存在。前提是指被菌体直接用于产物合成而自身结构无显著改变的物质。当前体物质的合成是产物合成的限制因素时，加入前体可以增加产物的产量和在某种程度上控制生物合成的方向。加入促进剂可刺激菌株的生长，提高发酵产量，缩短发酵周期。,食品生物技术第四章发酵工程及其在食品工业中应用,发酵工程的一般过程：,菌株的纯化育种：菌株来源有三种途径：a,从自然界分离筛选;b.从菌株保存机构已知菌种中分离；c.从生产过程中分离筛选，包括基因工程手段改造工程菌。还需要定期对菌株纯化和育种。种子的扩大培养：是个逐级扩大培养而获得一定数量和质量的纯种的过程。这些纯种培养物称为种子。发酵：发酵过程的中心环节，所用的培养基和培养设备都必须灭菌，通入的空气或中途补料都是无菌的，转移种子也要常用无菌培养技术。下游处理：指发酵结束后对发酵液或生物细胞进行分离和精制，制成符合要求的产品。,食品生物技术第四章发酵工程及其在食品工业中应用,发酵的方式：,分批发酵：营养物和菌种一次加入进行培养，直到结束放出，中间除了空气进入和尾气排除外，与外部没有物料交换。传统的生物产品的发酵多用此过程。除了控制温度和pH及通气以外，不进行其他控制，操作简单。从细胞所处的环境来看，则变化明显，发酵初期营养物过多，可能抑制微生物的生长，而中期又因营养物减少而降低培养效率。从细胞增殖来说，初期细胞浓度低，增长慢，后期细胞浓度虽高，但营养物浓度过低也长不快，总的生产能力不高。（画图表示六个时期的生长曲线：延滞期、短暂的加速期、指数生长期、减速期、稳定期和衰亡期），分批发酵属于封闭系统。连续发酵：指以一定的速度向发酵灌内添加新鲜培养基，同时以相同的速度流出培养液，从而使发酵灌内的液体量维持恒定，微生物在稳定状态下生长。稳定状态可以有效地延长分批培养中的对数期。微生物所处的环境条件，如营养物的浓度、产物浓度、pH值等保持稳定，微生物细胞的浓度及其比生长速率也可维持不变。甚至可根据需要调节。补料连续发酵：又叫半连续发酵，介于分批发酵和连续发酵之间的一种发酵技术。指在微生物分批发酵中，以某种方式向培养系统补加一定的物料的培养技术。通过补充物料，可以使培养液中的营养物浓度较长时间地保持在一定范围内，既保证了微生物的生长需要，又不造成不利影响，从而提高了产率。,食品生物技术第四章发酵工程及其在食品工业中应用,连续发酵的优缺点（与分批发酵相比）：,优点：维持稳定的操作条件，利于微生物生长代谢，产率和产品质量也保持稳定；更有效地实现机械化和自动化，降低劳动强度，减少操作人员与病原微生物和毒性物质接触的机会；减少了设备清洗、准备和灭菌等非生产占的时间，提高设备利用率；延长了仪器探头的寿命（由于灭菌次数的减少）；容易对过程进行优化，有效提高发酵产率。缺点：容易造成污染（由于系统开放和发酵周期长）；对设备、仪器及控制元器件的技术要求高；粘性丝状菌菌体容易附壁上生长和在发酵液里结团，给连续操作带来困难。连续发酵技术目前主要用于理论研究，基本上未进行实际应用。,食品生物技术第四章发酵工程及其在食品工业中应用,两种补料分批发酵：,单一补料分批发酵，开始时投入一定量的基础培养基，到发酵过程的适当时期，开始补加碳源和（或）氮源或（和）其他必需基质，直到发酵液的体积达到发酵灌最大操作容积后，停止补料，最后发酵液一次全部放出。由于受发酵灌操作容积的限制，发酵周期只能控制在较短的范围内；反复补料分批发酵，在单一补料分批发酵的基础上，每隔一定时间按一定比例放出一部分发酵液，使发酵液的体积始终不超过发酵灌的最大操作容积，延长发酵周期，直至发酵产率明显下降，才最终将发酵液全部放出。既保留了单一补料分批发酵的优点，又避免了它的缺点。,食品生物技术第四章发酵工程及其在食品工业中应用,补料分批发酵的优点：补料分批发酵是分批发酵向连续发酵的过渡，兼有两者的优点，又克服了两者的缺点。与分批发酵相比，首先可以解除营养物基质的抑制、产物反馈抑制和葡萄糖分解阻遏效应。对于好氧发酵，可以避免分批发酵中一次性投入糖过多造成细胞大量生长，耗氧过多，导致通风设备不能匹配的状况。还可以减少菌体生长量，提高有用产物的转化率。与连续发酵相比，它不会产生菌种老化和变异的问题，适用范围也比连续发酵广。随着研究工作的深入和微机在发酵过程自动控制中的应用，补料分批发酵技术将日益发挥其巨大的优势。,食品生物技术第四章发酵工程及其在食品工业中应用,发酵工艺的控制：温度：最适温度是既适合菌体的生长，又适合代谢合成的温度。随菌种、培养基成分、培养条件和菌体生长阶段不同而改变。pH值：pH值的变化取决于菌种、培养基成分、培养条件溶解氧浓度，发酵液的需氧量受菌体浓度、基质种类和浓度以及培养条件等因素的影响，其中以菌体浓度最为明显。放灌时间，根据不同发酵时间所得到的产物产量计算出发酵的生产力和产品成本，采用生产力高而成本又低的时间作为发给时间。要考虑的指标有产物的产量、过滤速度、氨基氮含量、菌丝形态、pH值、发酵液的外观和粘度等，,食品生物技术第四章发酵工程及其在食品工业中应用,发酵设备,食品生物技术第四章发酵工程及其在食品工业中应用,下游加工过程：发酵液预处理和固液分离：预处理的目的是改善发酵液的性质，以利于固液分离（常用酸化、加热、加絮凝剂等方法）。固液分离常用过滤、离心等方法。如目的产物在细胞内，还需要破碎细胞。方法有机械的（如研磨，超声波处理，高压均质法，冷冻解冻交替处理法），生物的（酶处理）和化学的（氢氧化钠、乙酸、草酸、柠檬酸、尿素甲苯、氯仿和甲醇盐酸等）提取,目的主要是浓缩，也有一定的纯化作用。常用的方法有：1、吸附法2、离子交换法3、沉淀法4、萃取法5、超滤法等精制：提取中方法也可以用于精制。大分子（蛋白质）依赖于层析分离；小分子物质的精制常利用结晶操作。成品加工：根据产品要求，进一步浓缩、无菌过滤、去热原、干燥、加稳定剂等步骤。随着膜质量的改进和膜装置性能的改善，膜技术在下游加工过程中使用越来越多。浓缩可采用升膜或降膜式的薄膜蒸发，热敏感性物质，可用离心膜蒸发。对大分子溶液的可用超滤膜浓缩，小分子溶液可用反渗透膜。截断分子量为10，000的超滤膜可以除去分子量在1000以内的产品中的热原同时达到了除菌的目的。干燥方法因物料性质、状态及具体条件可选用真空干燥、喷雾干燥和冷冻干燥等方法。,食品生物技术第四章发酵工程及其在食品工业中应用,固体发酵：是指微生物在无游离水或几乎没有游离水的固体物质上生长发酵的过程。某些微生物生长需水很少，可以利用疏松而含有必需营养物的固体培养基进行发酵生产。我国传统的酿酒、制酱及天培（大豆发酵食品）的生产均有一个固体发酵期。固体发酵还可以用于蘑菇的生产、奶酪、泡菜的制作以及动植物废料的堆肥等。固体发酵所用原料一般为经济易得、富含营养的工农业中的副、废品，如麸皮、薯粉、大豆饼粉、高梁、玉米粉等。固体发酵一般都是开放的，无菌要求不高。所需设备简单，操作容易，可因陋就简、因地制宜。但劳动强度大、不便于机械化操作、微生物品质少，生长慢，产品有限等。目前主要的发酵生产多为液体发酵。,食品生物技术第五章细胞工程及其在食品工业中应用,细胞工程：指以细胞为单位，在体外进行培养和繁殖或使细胞某些生物学特性按人们的意志发生改变，从而达到改良生物品种和创新品种，加快繁殖个体或获得某种有用物质的过程。细胞工程是在细胞水平研究开发、利用各类细胞的工程。操作对象是细胞。细胞工程应包括动植物细胞的体外培养、细胞融合技术（细胞杂交技术）、核移植技术、细胞代谢物的生产和生物克隆等。,食品生物技术第五章细胞工程及其在食品工业中应用,第一节细胞工程基础知识原核细胞（细菌、放线菌等），外有细胞壁（由肽聚糖组成，细胞融合的主要障碍），生长迅速，是细胞改造的良好材料。真核细胞（酵母、动植物细胞），植物细胞有细胞壁（由纤维素组成）细胞工程的所有实验都要求在无菌条件下进行。实验操作应在无菌室内进行，超净工作台是最基本的实验设备，对生物材料和所用的一切器械、器皿和药品都应灭菌或除菌。无菌操作意识和彻底除菌是成功的一个关键。,食品生物技术第五章细胞工程及其在食品工业中应用,细胞融合：两个或多个细胞相互接触后，其细胞膜发生分子重排，导致细胞合并、染色体等遗传物质重组的工程称为细胞融合。是细胞工程的重要基础技术。细胞融合的主要过程：,1.制备原生质体（除去植物细胞和微生物细胞的细胞壁）2.诱导细胞（原生质体）融合（PEG，CaCI2，或电激方法）3.筛选杂合细胞（让杂合细胞选择性地长出，未融合细胞无法生长）*原生质体：包括细胞核和细胞质中所有内容物的亚细胞结构物质一块统称为原生质体。,食品生物技术第五章细胞工程及其在食品工业中应用,促进细胞融合的方法（P175）生物学法（病毒促进细胞融合，仙台病毒、疱疹病毒、天花病毒等）化学融合剂（PEG，二甲基亚碸、甘油磷酸酯等，PEG最为广泛）电处理融合法（电激法，高频电场脉冲）,食品生物技术第五章细胞工程及其在食品工业中应用,原生质体融合的步骤:1.具有标记菌种的筛选和稳定性鉴定(营养缺陷型，高渗溶液保存)2.原生质体制备与再生超声波破碎法：很难得到完整的原生质体球酶法：细菌、放线菌（EDTA溶菌酶）；革兰氏阳性（溶菌酶）；革兰氏阴性菌（EDTA溶菌酶）。酵母（蜗牛酶，helicase）；丝状菌（纤维素酶和纤维素酶加上蜗牛酶）；霉菌（单独壳聚糖酶或与其它酶配合）*用对数生长期的培养物制备原生质体较为合适。*原生质体的再生（原生质体经培养后回复原来细胞形态的过程）十分重要，再生率一般为3%10%,最高的达5080。再生培养基加入牛血清蛋白，再生率几乎可达100。3.原生质体融合：原生质体数ABA未经渗透休克处理的即用高渗稳定液作稀释液涂布于再生平板长出的菌落，即原生质与未去壁细胞的总和B涂布之前用低渗溶液（如水）渗透休克处理使原生质体破裂失活后，再涂布长出的菌落，即为未破壁的菌体细胞数。,食品生物技术第五章细胞工程及其在食品工业中应用,融合重组体的鉴别直接法：融合液直接涂布于没有补充两亲株生长所需要的营养物的培养基的平板上，直接筛选出融合重组体；间接法：先将融合液涂布于营养丰富的培养基的平板上，使未融合的亲本菌株和重组的菌株都能生长，然后再用影印法接种到选择培养基上找出重组体菌株。*选择的困难在于融合子的不稳定性和融合子的复杂性：杂合双倍体或单倍重组体属真正的融合，较为稳定。凡不稳定而易分离为亲本类型的融合作用，称为暂融。,食品生物技术第五章细胞工程及其在食品工业中应用,细胞培养技术细胞培养指的是动物、植物和微生物细胞在体外无菌条件下的保存和生长。不同来源的细胞培养对营养要求差异很大，但作为细胞培养有一定的共同之处：1、取材和除菌：动物细胞在取材前，植物细胞在取材前后都要对取材部位进行严格的表面清洗消毒（有时用酶处理以得到分散生长的细胞）；2、配制培养基并消毒，无菌操作把材料接种到培养基上（中）；3、接种好的培养基在培养室或培养箱中培养；4、当细胞生长到一定生物量时，及时收获或传代。*培养过程中提供最佳条件：温度、湿度、光照、氧气和二氧化碳等。,食品生物技术第五章细胞工程及其在食品工业中应用,组织培养和细胞培养细胞培养指的是离体细胞在无菌条件下的分裂、生长，在整个培养过程中不出现分化，不形成组织；而组织培养意味着取自动物体（植物体）的某类组织，在体外培养时细胞一直保持原本分化的特性，该组织的结构和功能持续不发生明显变化。*经常有很多人混淆了两个概念。,食品生物技术第五章细胞工程及其在食品工业中应用,第二节动物细胞的培养方法动物细胞工程是细胞工程的重要分枝。利用生物学及工程学的原理定向改造动物细胞遗传性，创造新物种，通过工程化为人类提供名贵药品及服务的技术，谓之动物细胞工程。1907harision培养蛙胚神经细胞（存活数周并长出了轴突），称为公认的动物组织培养的鼻祖。1958冈田善雄发现灭活后仙台病毒可以诱导艾氏腹水瘤细胞融合1960s，童弟周等进行了鱼类和两栖类中大量的核移植1975kohler和milstein巧妙地创立了淋巴细胞杂交瘤技术并得到单克隆抗体。1997英国的Wilmut领导的小组用体细胞核克隆出Dolly绵羊，动物细胞工程已达到世纪辉煌顶峰。,食品生物技术第五章细胞工程及其在食品工业中应用,动物细胞培养的特点：细胞生长缓慢，易受微生物污染，培养时需用抗生素；动物细胞大（比微生物细胞大得多），无细胞壁，机械强度低，适应环境能力差；培养过程需要氧量少，不耐强力通风和搅拌；培养中具有群体效应、锚地依赖性（需要附着在固体半固体表面上才能生长）、接触抑制性及功能全能性。培养过程中产物分泌到细胞内外，过程成本高，产品价值昂贵；除需要植物、微生物培养基成分外，还需要加入血清成分和动物激素；对环境敏感，培养条件要求控制严格。原代细胞一般繁殖50代即退化死亡。,食品生物技术第五章细胞工程及其在食品工业中应用,无血清细胞培养基P180181基础培养基加上代血清的补充因子，见表5-2和表5-3动物细胞的培养方法（根据锚地依赖性）：灌注悬浮培养贴壁细胞培养固定化细胞培养,食品生物技术第五章细胞工程及其在食品工业中应用,动物细胞大量培养的应用例子,生产疫苗（如口蹄疫疫苗、狂犬疫苗、脊髓灰质炎疫苗、白血病疫苗等，即可节约大量的动物，且生产周期短，安全可靠，可以大量生产）生产生物活性物质（如蛋白质干扰素、单克隆抗体）基因工程细胞培养（可以转译和加工较大的或更复杂的克隆蛋白质，并进行大量生产，如免疫球蛋白、血凝因子、促细胞生成素及各种抗原）,食品生物技术第五章细胞工程及其在食品工业中应用,第三节植物细胞工程及应用定义与内容：根据生物学及工程学的原理定向改造植物细胞遗传性，利用植物细胞为人类提供名贵药品及服务的技术，谓之植物细胞工程。内容包括植物细胞及其原生质体的培养、植物原生质体的融合、植物细胞反应器及其反应动力学、细胞大规模培养及次生代谢物的生产等。植物细胞的培养特性1.植物细胞较微生物细胞大的多，外有纤维素细胞壁，耐拉不耐扭，抵抗剪切力差；2.生长缓慢，易受微生物污染，需用抗生素；3.细胞生长的中期和对数期易凝聚成团，悬浮培养困难；4.培养需过氧，培养液粘度大，不耐强力通风搅拌；5.具有群体效应，无锚地依赖性及接触抑制性；6.培养的细胞产物潴留在细胞内，且产量低；7.培养过程具有结构和功能全能性。培养的类型愈伤组织培养、悬浮细胞培养、器官培养、茎尖分生组织培养、原生质体培养和固定化细胞培养,食品生物技术第五章细胞工程及其在食品工业中应用,植物细胞的营养成分和培养基#初级代谢产物生产和次级代谢产物生产，因此，适于细胞生长的培养基不一定利于二次代谢产物的生产。#培养基应包括植物生长所需要的16种元素和某些生理活性物质，可分为5大类：无机营养物，13种元素为植物所必需的因素，其中6种为大量元素（N,K,Ca,Mg,S）,另外7种必需的微量元素（Fe,B，Mn,Cu,Zn,Mo,Cl）有机物质,分为有机营养物质（提供碳、氢、氧、氮等因素，如糖类、氨基酸及其酰胺类如天冬酰胺）和生理活性物质如维生素如硫胺素（B1）、吡哆醇（B6）、烟酸、生物素、肌醇、单核苷酸及其碱基如腺嘌呤等。植物生长刺激物，主要为天然植物激素和人工合成的类似生长激素的物质如生长素（吲哚乙酸、萘乙酸等）、细胞分裂素（激动素、玉米素）、赤霉素、脱落酸和乙烯类激素。其它附加物，不是必需的，但是有利的，如琼脂（不要成分）、活性炭（吸附有害代谢物）、聚蔗糖（Ficoll）和琼脂糖（agrose）（改善供氧状况）。其它对生长有益的未知成分，如植物的天然汁液如椰乳、酵母提取物、苹果汁等，作用是提供必要的微量元素和生理活性物质和生长激素类物质。,食品生物技术第五章细胞工程及其在食品工业中应用,培养基的种类：很多种，根据培养的材料和目的选择合适的培养基。P187191培养基的配制P1911921.培养基母液的配制：大量元素混合母液（10X）微量元素混合母液（1001000 x）铁盐母液（FeSO4与Na2-EDTA）(200 x)有机化合物母液（0.110mg/ml）植物激素（0.110mg/ml）2.培养基的配制：混合培养基的各成分溶化琼脂混合调pH分装灭菌备用,食品生物技术第五章细胞工程及其在食品工业中应用,植物细胞培养的类型与技术植物细胞悬浮培养技术：分批培养法、半连续培养法和连续培养法*悬浮培养技术适于大量快速地增殖细胞，不利于次生物质的积累。*悬浮培养中培养物所处的微环境不同（不均一性）由于植物细胞在培养中结块，块内外部的细胞所得到的养分、空气和生长物质不同，导致细胞大小、形状、代谢和生长的不均一性。这是该法的特征和缺陷。单细胞培养技术：看护培养法、微室培养法和平板培养法植物细胞固定化培养技术*细胞生长缓慢而次生物质的含量相对较高。,食品生物技术第五章细胞工程及其在食品工业中应用,植物细胞培养要解决的技术难点P197198,缩短生产周期，降低生产成本：与微生物细胞相比，植物细胞生长缓慢生产周期一般2535天（微生物一般只有3天左右）。设备、人力能源消耗多成本高，效率低下。提高培养细胞中有效成分的含量：培养细胞中的有效成分往往比原来细胞中的含量低，要选出有效成分高的细胞株进行培养。防止细胞聚积成块：成块导致培养细胞不均一性，影响产品的质量和产量。从选材（选易分散）、提高生长素浓度和加入试剂（EDTANa螯合剂和果胶酶）几个途径解决。防止细胞株退化与变异。,食品生物技术第五章细胞工程及其在食品工业中应用,单细胞培养技术单细胞培养方法P198201影响细胞生长的因素,看护培养法微室培养法平板培养法,条件培养基（生长悬浮细胞的液体培养基）的作用细胞密度（要高于临界浓度，因为植物细胞培养具有群体效应）生长激素pHCO2浓度（大气CO2浓度为0.03%,提高到浓度1促进分裂，2则抑制分裂）,食品生物技术第五章细胞工程及其在食品工业中应用,植物细胞固定化培养技术（自学）固定化细胞的优点：高度保持反应槽内细胞的量（即生物体催化剂的量），提高反应效率；反应活性稳定，可长期连续运行；易与产物分离；最适宜的环境条件和基质浓度等易于控制；大多数次生代谢物主要由处于稳定增殖期的细胞生产，所以应固定稳定期的细胞，以避免固定化对细胞生长发育的抑制。,食品生物技术第五章细胞工程及其在食品工业中应用,植物细胞固定化培养技术（自学）植物细胞固定化的方法和材料P201204包埋（海藻酸盐，k-角叉菜胶，琼脂及琼脂糖，聚丙烯酰胺凝胶和其它包埋载体如聚氨基甲酸乙酯泡沫塑料和氨基酸乙酯聚合物等以及膜包埋固定化）吸附共价结合生物反应器的放大，在放大过程中常常由于物理或化学条件的改变而引起产物产率的下降，原因有多方面的。,食品生物技术第五章细胞工程及其在食品工业中应用,植物细胞培养生物反应器的类型及其放大,机械搅拌罐,非机械搅拌罐,反应器类型,悬浮培养生物反应器,固定化细胞生物反应器,填充床反应器,流化床反应器,膜反应器,食品生物技术第五章细胞工程及其在食品工业中应用,植物细胞培养的应用一、植物细胞的生产（西洋参为例）二、初级和次级代谢物的生产（食用色素为例）三、生物转化影响次生代谢物产生的因素,组织来源,培养条件,化学条件：碳水化合物、氮供应、生长调节物质,物理条件：光、温度、通气、pH,影响因素,食品生物技术第六章生物技术在饮料工业中应用,饮料是食品工业的一个支柱产业，把生物技术应用于饮料生产，可以提高资源利用率，促进开发新产品，改进生产工艺、提高产品质量。特别是在发酵乳酸饮料、植物蛋白饮料、果汁的加工生产、啤酒生产和保健饮料的生产方面发挥着越来越重要的作用。,食品生物技术第六章生物技术在饮料工业中应用,第一节生物技术在发酵乳饮料中的应用两大类发酵乳：酒精发酵乳和乳酸发酵乳，前者为酵母和乳酸