成年小鼠心脏灌流_第1页
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文档简介

成年小鼠的心脏灌注实验材料：需要观察大脑切片的老鼠试剂/试剂盒：乙醚。生理盐水(37水浴)；4% PFA；30%蔗糖仪器：蠕动泵；剪刀；镊子。针头；导管实验步骤：1.准备实验设备：两个圆锥形瓶子(一个装生理盐水，另一个装4%多聚甲醛，记得用密封膜密封)2.用生理盐水冲洗导管，并去除导管中的气体。(在灌注期间，选择雄性动物比雌性动物更好，因为雌性动物受其激素周期的影响，而雄性动物的结果更可靠)3.在密封的容器中加入适量的乙醚来麻醉小鼠。(应该注意的是，为了防止血液凝固给灌注带来阻力，老鼠稍微醒来比死去要好。)4.麻醉后立即用针将鼠标固定在泡沫板上(将针插入四肢)。5.一只手用镊子拔起胸部皮肤，另一只手用剪刀剪开胸部皮肤和肋骨，露出心脏和肝脏。6.将注射针插入小鼠左心室(如果注射针不稳定，可用镊子将其固定在泡沫板上)。同时，减去老鼠的肝脏使血液流出。灌注速度为5.8转/分(生理盐水的灌注时间维持在10分钟左右，去血后四肢、肝脏和舌头会变白)7.切下老鼠的尾巴，取样进行基因分型。同时，灌注信息记录在小鼠信息卡上，小鼠的灌注信息记录在自己的实验笔记本上，以便于后续的基因分型操作。8.小鼠的四肢、肝脏和舌头变白后，从生理盐水中取出导管的起始端，放入4%PFA溶液(4)的冰浴中，用4%PFA灌注固定。当PFA流向大脑时，小鼠的尾巴可能会轻微反射(有时可能不会)，此时，灌注速度可从5.8转/分调整到4.8转/分，以使固定更充分。PFA的灌注时间约为20min。(固定原理：多聚甲醛可以交联蛋白质)9.将导管的起始端从PFA中取出。导管中的液体完全排出后，将针头从心脏中取出。如果针固定得好，老鼠的眼球可以被发现是白色的。将托盘中的血液倒入废液桶中，为下一次脑提取手术做准备。10.拿出一条纸巾，把鼠标放在上面，沿着脖子切下头部。11、切开头部皮肤，露出白色头骨。切除延髓囊的软骨，去除多余的结缔组织。需要注意的时候，眼睛应该用剪刀剪开，不能直接拉，因为眼睛的后部与视神经相连，如果拉，可能会损伤其他脑组织，如视交叉上核。12.小心地剥下头骨，露出脑白质。剥下嗅球时要格外小心。如有必要，嗅球前面的断骨可以留着在取出前进一步固定。13.颅骨剥离后，连接到大脑下部的神经被一个接一个地切断(视神经可以看到交叉)，在所有神经被切断后，整个大脑被剥离。14.将剥离的大脑浸泡在4%的PFA中并固定过夜。15.用30%蔗糖代替PFA溶液进行脱水(以防止在冷冻和切片过程中形成
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