标记HRP——简易过碘酸钠法

高碘酸钠标记辣根过氧化物酶的简易方法1.原则：在经典的高碘酸钠法中，二硝基氟苯用于封闭HRP上残留的-和-氨基，以避免酶分子之间的交联。后来威尔逊和其他人在低PH值下用四氧化二钠氧化辣根过氧化物酶，从而消除了用二硝基氟苯封闭辣根过氧化物酶的步骤。辣根过氧化物酶(HRP)与氨基过氧化物酶(NaIO4 4)氧化形成的醛类酶可与抗体分子的氨基相连，形成席夫碱，该席夫碱可进一步被氨基过氧化物酶(NaBH4)或乙醇胺还原，生成稳定的酶标记抗体。试剂和设备(1)称取0.1 mnaio4: 241mg高碘酸钠，溶于10ml蒸馏水中。(2)1毫升4.4醋酸钠缓冲液：0.2毫升(1.361克/50毫升)3.7毫升0.2毫升(0.601毫升/50毫升)6.3毫升向2000毫升中加入蒸馏水。(3)0.2 ph9.5碳酸盐缓冲液：Na2CO30.32碳酸氢钠30.586克加入蒸馏水至50毫升用蒸馏水稀释20倍，得到0.01MPH9.5的碳酸盐缓冲液(4) nabh4溶液(4毫克/毫升):在1毫升蒸馏水中称取44毫克NaBH，立即使用。(5)0.15 ph7.4磅(6)饱和硫酸铵操作步骤(1)称取5mgHRP并溶于1毫升蒸馏水中。(2)向上层溶液中加入0.2毫升新制备的0.1毫纳4溶液，在室温下黑暗中搅拌20分钟。(3)将上述溶液放入透析袋中，透析1毫升4.4毫升醋酸钠缓冲液，在4下过夜(4)加入20l 0.2 MPh 9.5碳酸盐缓冲液，将上述醛化芪RP的PH值升至9.0-9.5，然后立即在1ml 0.01m碳酸盐缓冲液中加入10mg IGg(抗体，或SPA5mg)，并在室温下避光轻轻搅拌2小时。(5)加入0.1毫升新制备的4毫克/毫升nabh4溶液，充分混合，并在4放置2小时。(6)将上述溶液放入透析袋中，透析0.15MPH7.4PBS，在4下过夜。(7)搅拌下滴加等体积饱和硫酸铵，并在4下静置；1小时。(8)以3000转/分的速度离心半小时，弃去上清液。沉淀物用半饱和硫酸铵洗涤两次，最后将沉淀物溶解在少量0.15MPH7.4 PBS中。(9)将上述溶液放入透析袋中，透析0.15MPH7.4的PB缓冲盐水，除去铵离子(用萘试剂检测)，以10，000rpm离心30分钟除去沉淀，取上清液作为酶结合物，分装，冷冻保存。结果确定定量和摩尔比测定：可通过分光光度计(光程1cm)测定。酶量(毫克/毫升)=od 403 nm 0.4IgG(mg/ml)=(od 280nm-od 403nm 0.3)0.62酶量(毫克/毫升)igg量(毫克/毫升)酶量摩尔比=-440，000160，000 IgG操作步骤(1)称取5mgHRP，溶于0.5毫升蒸馏水中。(2)向溶液中加入0.5毫升新配制的0.1毫纳4溶液，混合均匀，在4下静置30分钟。(3)加入0.5毫升0.16毫升乙二醇水溶液，混合均匀，静置30分钟。(4)加入1毫升含5毫克抗体的水溶液，混合均匀，放入透析袋中，用pH9.5的碳酸盐缓冲液透析，并在4过夜。(5)加入0.2毫升新制备的5毫克/毫升nabh4溶液，充分混合，并在4放置2小时。(6)搅拌下滴加等体积饱和硫酸铵，并在4下静置；41小时。(7)以3000 r/min离心半小时，弃去上清液。沉淀物用半饱和硫酸铵洗涤两次，最后将沉淀物溶解在少量的0.15摩尔/LpH7.4 PBS中。(8)将上述溶液放入透析袋中，透析0.15毫升/升的生理盐水，除去铵离子(用萘试剂检测)，以10，000转/分钟的速度离心30分钟，除去沉淀，取上清液作为酶结合物，分装，冷冻保存。有关注意事项(1)为了提高标记效率，应严格控制整个反应体系中的抗体含量。(2)碘酸钠应新鲜制备。操作步骤(1)将5毫克辣根过氧化物酶溶于1毫升酸碱度为5.6、酸碱度为0.2毫升/升的醋酸缓冲溶液中，加入0.1毫升1%DNFB无水乙醇溶液，室温下轻轻搅拌1小时；(2)加入0.1摩尔/毫升40.5毫升新鲜配置的溶液，此时溶液由原来的棕色变为深绿色，并在4放置30分钟，此时溶液由原来的棕色变为深绿色；(3)加入1毫升2.5%的乙二醇，室温下轻微搅拌1小时，终止反应；(4)加入5-10毫克待标记抗体，用1.0毫升/升和9.5毫升/升的磷酸盐缓冲液调节酸碱度至9.0；(5)混合均匀，4静置；c过夜(6)加入0.1毫升草皮(1)当氧化辣根过氧化物酶时，pH5.6的乙酸盐缓冲液适合溶解酶。(2)一般认为，在5毫克时，HRP被氧化，而NaIO4为0.06摩尔/10.5毫升，不低于0.015摩尔/10.5毫升(3)氧化辣根过氧化物酶的适宜时间为15-30分钟。(4)添加DNFB以阻断酶蛋白中残留的a-和e-氨基。(5)加入乙二醇的目的是终止反应；为了在加入抗体后调节酸碱度，乙二醇应该用0.05摩尔/LCBS制备。改进的高碘酸钠法；(1)将5mgHRP溶于0.5毫升双蒸水中，加入0.06摩尔/微升四氧化二铝水溶液(10毫升双蒸水128 MGN AIO 4) 0.5毫升，混匀，置于430分钟；(2)取出后，加入0.16摩尔/升乙二醇水溶液(10毫升水0.09毫升乙二醇)0.5毫升，室温放置30分钟；(3)加入1毫升含5毫克纯化抗体的水溶液，混合均匀，放入透析袋中。缓慢搅拌并透析0.05毫升/9.5毫升碳酸盐缓冲溶液6小时(或过夜)以合并它们；(4)加入0.2毫升硼氢化钠溶液(5毫克/毫升)，混合均匀，在4放置42h；(5)向上述溶液中缓慢加入等体积的饱和硫酸铵溶液，混合均匀，在4离心430分钟，除去上清液，用少量0.02摩尔/升的7.4磅溶液溶解沉淀，装入透析袋中，用相同的液体在4透析脱盐过夜；取出，第二天离心除去不溶物，得到酶-抗体(HRP-IgG)结合物，加入0.02摩尔/100毫升7.4磅溶液至5毫升；效价测定合