免疫学抗体

第二章 抗体,第二章 抗体,主要内容：抗体的概念抗体的结构，各功能区的功能抗体的抗原性抗体的生物学功能,重点：抗体的结构、功能区、免疫学功能。难点：抗体的抗原性、功能区、高变区(CDR)、McAb、中和抗体等概念。目的要求：掌握抗体的概念、抗体的结构、 抗体功能区、抗体的免疫学功能。,1901年Behring由于在运用抗毒素血清预防和治疗白喉和破伤风等病症方面；1919年Bordet发现抗原和抗体相互作用的结果是激活补体，导致携带抗原的靶细胞的裂解；1972年美国Gerald Maurice Edelman和英国Rodney Robert Porter由于在抗体结构上的突出贡献被授予诺贝尔医学及生理学奖；1984年丹麦免疫学家Niels K.Jerne、德国免疫学家Kohler和美国著名生物化学价Cesar Milstein在发现生产单克隆抗体的原理而共同获得诺贝尔生理学或医学奖；1987年利根川进在基因水平上对抗体多样性形成的机制进行了探索，证实了免疫球蛋白的基因结构，在免疫球蛋白研究领域取得了突破性进展。,X射线晶体衍射显示抗体分子立体结构,抗体（antibody，Ab）： 在抗原和免疫系统的相互作用下，由B淋巴细胞转化浆细胞产生的能与相应抗原发生特异结合的免疫球蛋白（immunoglobulin）。包括IgG、IgM、IgA、IgD、 IgE,第一节 抗体与免疫球蛋白的概念,曾有抗毒素、杀菌素、溶菌素、凝集素、沉淀素、溶血素、红斑狼疮因子、类风湿因子等名称。,是具有抗体活性或化学结构与抗体相似的球蛋白,免疫球蛋白(Immunoglobulin, Ig)：,非抗体,存在形式： 膜型（membrane immunoglobulin, mIg） B细胞膜上的抗原受体； 分泌型(secreted immunoglobulin, sIg) 分泌进入体液,介导体液免疫应答。,(1)抗体是与抗原相对应的一个概念，着重点在 其生物学活性；(2)免疫球蛋白是结构和化学本质上的概念；(3)抗体都是免疫球蛋白，免疫球蛋白质并非都 是抗体，它包括抗体球蛋白、异常免疫球蛋 白等。如骨髓瘤患者血清中的骨髓瘤蛋白，其化学结构与Ab相似，但无Ab活性，没有免疫功能，不能称为Ab。,通常情况下二者可通用。 球蛋白 = 丙种球蛋白 = 抗体分子,抗体与免疫球蛋白的关系：,第二节 抗体的结构,抗体分子巨大，含有1000个以上的aa残基。但各类抗体都具有相似的基本结构。,即所有抗体都由1个或多个单体组成。,单体：由四条多肽链和几对二硫链接成的一个基本单位称为Ig单体。,一、单体结构,四肽链结构 所有Ig的基本单位都是四条多肽链的对称结构。重 链（heavy chain，H链） 其中两条相同的长链称为重链，由446个aa组成，结合有不同含量的糖，故Ig属糖蛋白。轻 链（light chain，L链） 两条相同的短链称为轻链，由214个aa组成。 重链和轻链 二硫键连接,稳定区与可变区,稳定区（constant region，C区） 肽链aa组成和排列相对恒定区域，称为稳定区，决定着抗体分子的多种生物活性，由L的1/2、H的3/4组成。 根据H链恒定区氨基酸组成和排列顺序不同分为： 重链分5类： Ig： IgA IgG IgD IgE IgM 根据L链恒定区氨基酸组成和排列顺序不同分为： 两型： 、,可变区（variable region，V区） 抗体分子肽链N-端，L链的1/2和H链的1/4的aa组成和排列顺序多变，故称可变区。是识别AD和决定抗体特异性的部位。,对来自不同B细胞克隆的Ig轻链氨基酸序列进行比较，发现V区的变化主要集中在3个分别由610个氨基酸残基组成的狭小区域内。,超变区/互补决定区,框架区,高变区与框架区高变区（hypervariable region）： 在V区内，重链与轻链各有3个特殊区域，在这些区域aa排列顺序变化大大超过V区的其他部分，这些区域称为超变区或高变区，又叫互补决定区(complementarity-determing region ， CDR)。框架区（Framework region，FR):维持超变区的空间构型,FR1,FR2,FR3,FR4,每条L链和H链的高变区相互作用形成一个单一的抗原结合位点。每个IgG分子有2个抗原结合位点，在功能上称为双价抗体。,抗原,B细胞表位,抗体 CDR,表位,免疫球蛋白的功能区 H链和L链上每隔110个氨基酸残基就通过链内二硫键连接形成跨度约110个氨基酸的环形结构区域（domain），具有不同的生物学功能，称为功能区。 轻链包括VL和CL两个结构域,重链含有1个VH和3-4个CH结构域。,（1）IgG、 IgA、 IgD的重链有4个功能区， 分别为VH、CH1、CH2、CH3；（2）IgM和IgE有5个功能区，即比IgG等多一个CH4。（3）轻链只有VL和CL两个功能区。,以IgG为例，各功能区的功能如下：1.VH和VL：结合抗原的部位。2.CH1和CL：遗传标志所在。3.CH2 ：有补体结合点，参与活化补体。4.CH3：可与细胞表面的Fc受体结合。,绞链区（hinge region） CH1和CH2之间，两个重链间二硫键连结处，能自由折叠，可以转动，弹性好，易被各种专一性不同的蛋白酶水解。 当抗体与抗原结合时，此区可转动，便于与抗原结合，另外亦可暴露CH2上的补体结合位点。原因：含大量脯氨酸和二硫键,Ig分子结合抗原前后的构象变化,BACK,二、抗体的其它结构J链与分泌片,J链（joining chain，J链） 分子量20KD，内含10%糖，富含半胱氨酸，由浆细胞合成。J链只有一种，它以二硫键的形式共价结合到Ig的重链上。功 能：连接Ig单体形成多聚体。 如IgM-五聚体、sIgA-二聚体,分泌片（Secretory piece，SP） 分子量60-70KD，含6%糖。分泌片由上皮细胞合成和分泌。分泌型IgA所特有的一种特殊结构功能：a.帮助IgA穿越黏膜b.保护sIgA抵抗蛋白酶的水解作用,分泌片,三、免疫球蛋白的水解片段与生物学活性,2个相同的抗原结合片断（fragment antigen binding，Fab)1个Fc片段，即可结晶片断（fragment crystallizable， Fc）,(一)木瓜蛋白酶水解：,1、酶解位点 H链间二硫键近N端。,2、酶解片断及其生物学活性,每个Fab片段有一条完整的轻链和部分重链。具有抗体活性，其结合抗原的部位在VL及VH功能区。,Fab,单价抗体，能与抗原结合形成可溶性复合物（不能形成网状结构？），无可见现象生成（沉淀、凝集）。如不加指示剂，则无可见现象。,由CH2和CH3组成，容易结晶。,Fc,与抗体的生物学活性有密切关系，如：与补体结合活化补体，与带Fc受体的细胞（M、B-C、K-C，嗜碱性粒细胞、肥大细胞）结合，引起各种生物学效应。,与具有FcR的吞噬细胞结合，可提高其吞噬能力。免疫学上称为调理作用，这类抗体称为调理素。这类亲细胞抗体在与抗原结合前或后都能与细胞结合，只是在与抗原结合后，增加了与细胞的结合能力。,1.调理吞噬作用,调理素：Wright于1903年观察到免疫血清能显著增强白细胞的吞噬作用，并将此种抗体称为调理素（opsonin）。,BACK,抗体依赖性介导的细胞毒作用（ antibody dependent cell-mediated cytotoxicity）,细胞毒素,2.ADCC作用,当当抗原为细胞且效应细胞为K-C或NK-C等时，靶细胞与相应的抗体结合，K-C或NK-C可与结合在靶细胞上的IgG的Fc片段结合，从而被活化，释放溶细胞因子，裂解靶细胞。,BACK,IL-4,BCR,IgE,3.引起过敏反应,效应细胞为肥大细胞、嗜碱性细胞时，引发型过敏反应。,BACK,记忆性B-C,B-C的Fc受体与SIg都能与同一种抗原结合，两者之间存在竞争同一种抗原的关系，由Fc受体结合的抗原通过胞饮作用进入B-C ，导致抑制因子的释放，而抗原与SIg的结合则导致B-C的活化。,4.免疫调节作用,BCR,IgG是唯一能通过胎盘的免疫球蛋白，与Fc片段及Fc受体有关。,5.与IgG选择性通过胎盘有关,1.酶解位点 H链间二硫键近C端2.酶解片断 1个大分子 F(ab)2 几个小分子 pFc,(二)胃蛋白酶水解,3. 酶解片断的生物学活性,F(ab)2 （1）具有双价抗体活性，因而与抗原结合能够形成沉淀，可见现象。 （2）其特性和功能与Fab相同。 pFc 无任何生物活性，为小分子肽，不能结晶。,克服了Fc抗原性而带来的副作用。,（三）综合应用,Fab片段或F(ab)2片段代替完整抗体试剂。,例如：白喉或破伤风抗毒素经胃蛋白酶消化后精制的制剂，可减少超敏反应的发生,其原因就是去掉了重链的Fc段。,克服了完整抗体分子与带有 Fc受体的细胞结合引起的非特异反应。,阐明Ig的结构及生物活性。,第三节抗体分类,异种抗体：微生物抗体,一、根据抗原的来源分,同种抗体：血型抗体,自身抗体：,异嗜抗体：针对异嗜性抗原产生的抗体 不同种属生物间存在的共同抗原。如大肠杆菌O86含有人的B血型物质，肺炎球菌14型含有人A血型物质。如O14与人类直肠粘膜具有共同Ag。,特异性 反应,完全抗体： 二价或多价抗体，与抗原结合，产生可见反应。？,二、根据与抗原是否产生可见反应,不完全抗体： 只有一个抗原结合部位。 能与颗粒抗原结合但不能产生可见凝集性反应，功能上为单价。,类 亚类： 型 亚型,三、根据理化特性和抗原结构分,（一）类和亚类,类(class)： 依据其重链C区的理化性质及抗原性差异。 Fc段氨基酸组成，约60%不同 重链决定Ig的种类。 IgG()、IgA()、IgM ()、 IgD()、IgE(),用于抗体的纯化可用二抗进行鉴定。,亚类： 类内相比又有18%不同。 根据重链C区的微细结构、二硫键的位置与数目、抗原性的不同小鼠： IgG1、IgG2a 、IgG2b、IgG3人： IgG1、IgG2 、IgG3、IgG4,1.羊抗鼠IgG1 2.羊抗鼠IgG2a 3.羊抗鼠IgG2b 4.羊抗鼠IgG3 5.羊抗鼠IgM 6.羊抗鼠IgG 7.1F9腹水,杂交瘤细胞染色体,SP2/0细胞染色体,例：氯霉素单克隆抗体制备与鉴定,单抗亚类的鉴定,（二）型和亚型,型：（1）根据轻链C区的抗原性不同，分为、两个型。（2）每个Ig分子中的两条轻链都是相同的，在一个Ig单 体分子上不可能同时出现和两种轻链。,亚型： （1）型轻链C区内氨基酸存在的微小差异，分为 1、2、 3、4四个亚型。 （2） 型轻链无亚型,Ig是蛋白质，因此一种动物的Ig对另一种动物具有抗原性。抗Ig抗体识别的Ig抗原决定簇（epitope）主要有三种：同种型、同种异型和独特型抗原决定簇。,第四节 Ig的抗原决定簇,同一种属所有个体的Ig分子共有的抗原特异性标志，不同种动物之间则不同，这种表位称为同种型。,1.同种型表位（isotypic epitope）,同种型表位在重链恒定区，决定Ig的类和亚类，是同一种属内所有个体共有的抗原决定簇。,轻链的同种型表位在其恒定区，有2种，决定轻链的、两型。,同一种属不同个体间，同一类型的Ig分子所具有的不同的抗原特异性标志。,2.同种异型表位（allotypic epitope）,位于轻链和重链的恒定区。,独特型是指每个Ig分子的V区肽链所具有的抗原特异性标志。,3.独特型表位（idiotypic epitope，Id）,独特位：免疫球蛋白分子上能结合抗原决定簇的可变区本身构成了一个独特型表位,这种AD可刺激自身、同种异体、异种动物产生抗体。,独特型,第五节 各类免疫球蛋白的理 化特性和免疫学功能,不同抗体分子理化特性有所不同，但都具有结合相应抗原的功能及各种生理效应功能。,1 IgG是介导体液免疫的主要抗体，是再次免疫的主要抗体；2 单体形式存在于血清和其它体液中；血清中含量最高，占血清Ig总量的3/4，半衰期最长(21天左右)；3 结合补体，激活补体的传统途径；4 唯一通过胎盘的Ig，穿过胎盘，介导新生儿抗感染免疫；5 结合巨噬细胞、中性粒细胞、NK细胞，参与调理吞噬和ADCC效应；6 其Fc段与葡萄球菌A蛋白（SPA）结合，可以纯化抗体，也可以用于免疫诊断；7 抗感染的主要抗体（抗菌、抗病毒、中和毒素)；同时也是血清学诊断和疫苗免疫后监测的主要抗体。,一、IgG,五聚体IgM：1 五聚体形式存在于血液中2 分子量最大，不能穿过血管壁和胎盘3 个体发育中合成最早的Ig，脐带血中IgM增多，提示可能存在宫内感染。4 IgM是抗原刺激后出现最早的抗体，半衰期短，故检测IgM水平可用于传染病的早期诊断。5 结合和激活补体的能力最强 ？6 调理吞噬和凝集作用比IgG强 ？单体IgM： 为mIgM，是B细胞的重要表面标志，是最早出现的BCR。,二、 IgM,三、IgA,血清型IgA：单体，存在于血清中。分泌型IgA（SIgA): 含J链和分泌片的二聚体，存在于胃肠道和支气管分泌液、初乳、唾液和泪液中。,1.分为两种类型：,3.SIgA是参与粘膜局部免疫的主要抗体 滴鼻、点眼、饮水,4.中和毒素、调理吞噬,2.SIgA不能通过胎盘，但初生动物可以从母乳中 获得SIgA。,四、IgE,1.种系进化中最晚出现的Ig，血清中含量最低2.单体形式存在3.结合肥大细胞和嗜碱性性粒细胞，参与I型超敏反应的发生4.在抗寄生虫感染中具有重要的作用。,五、IgD,1.单体形式存在血清中，含量低，仅占血清总Ig的1%；2.分子结构类似于IgG，但不能通过胎盘，也不能激活补体；3.表达在B细胞膜上的smIgD是成熟B细胞的重要标志，参与B细胞的活化、增殖和分化； 4.血清中的IgD功能不清,六、Ig的基因结构与Ab多样性的机制,（二）Ig的基因结构1.Ig重链VDJ基因重排及C基因类别转换 V区： V、D、J基因编码 V基因：CDR1、CDR2 D基因及V-D：大部分CDR3 D-J基因：CDR3其余部分及骨架区 C区：C基因编码 存在类别转换,（一）免疫球蛋白的基因库H基因库（重链基因连 锁群）第14号染色体2.基因库（链基因连 锁群）第2号染色体3.基因库（链基因连 锁群）第22号染色体,2.Ig轻链基因结构与VJ重排（1）Ig 型轻链基因：V、J、C V基因： CDR1、CDR2 V-J基因：CDR3 C基因： C区（2）Ig型轻链基因：V、J、C V基因：CDR1、CDR2 V-J： CDR3 C基因：C区,Human antibody genes,(三)Ig的基因结构及其重排和表达,1.链: V(约100个)、 J(5个)、 C(1个)2.链: V(约30个)、 J-C(4个) 3.H链: V基因(约95个) D基因(27个) J基因(6个) C基因(9个),（四）Ig的类别转换 1.定义 一个B细胞克隆在分化过程中V-D-J功能性基因片段保持不变，而发生C基因重排，使其表达的抗体分子发生H链类的改变，称为类别转换（class switching） 。 2.举例 B细胞克隆 IgM ,IgG,IFN-,IL-4,IgE,IL-5,IgA,(五)抗体多样性机制: 1.Ig受多基因控制 2.V-D-J及V-J连接的多样性 3.体细胞的基因突变 4.H 、L链的随机组合,第七节 免疫球蛋白的生物学功能,在蛋白质中，象Ig这样在一种分子中能表现如此多方面的生物活性的例子是少见的，IgG是其中的典型代表。Ig的主要功能概述如下：,Ig与Ag的结合具有高度特异性，必需是超变区与抗原的空间构象完全吻合。 与抗原结合后，可介导体内的多种生理和病理效应（中和病毒、毒素，介导炎症反应），体外可产生凝集、沉淀现象用于检测等 。,一、与抗原特异性结合,抗体（IgG1、 IgG2、 IgG3、IgM）与相应抗原结合后，发生变构，其重链恒定区上的补体结合点（CH2）暴露。C1q与之结合，从而使补体各成分激活。,二、激活补体,主要通过IgG/IgE的CH3/CH4功能域与位于不同细胞上的FcR/FcR结合，介导不同的生物学效应：,三、结合Fc受体,(1)与单核巨噬细胞和中性粒细胞上的FcR结合 介导调理吞噬作用；,(2)与肥大和嗜碱性粒细胞上的FcR结合介导I型超敏反应；,(3)靶细胞上的抗原决定簇结合IgG的Fab段，而抗体的Fc段与NK细胞上的FcR结合，发挥抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用（Ab dependent cell-mediated cytotoxicity,ADCC）。,IgG是人类唯一能从母体通过胎盘转到胎儿体内的Ig。新生儿消化道壁通透性较高，人和兔的IgG可通过胎盘，其他哺乳类IgG可通过初乳吸收，对新生儿抗感染起作用。,四、通过胎盘,第八节 单克隆抗体,多克隆抗体(polyclonal antibody)第一代抗体,一、单克隆抗体和多克隆抗体,指由不同B细胞克隆产生的针对抗原物质中多种抗原决 定簇的多种抗体混合物,如:免疫血清（含多种特异性抗体）。,应用 免疫学检测 被动免疫治疗和紧急预防存在问题 质量难以控制，不易标准化， 特异性差, 用于免疫学检测容易出现交叉反应。,单克隆抗体(monoclonalantibody, McAb) 第二代抗体 由单个B细胞克隆产生的、针对同一抗原表位的抗体。 特点： 高特异性、高均一性 应用： 广泛,McAb和多克隆抗体的比较,二、淋巴细胞杂交瘤技术,1975年，由Kohler和Milstein建立,1984年，获诺贝尔奖,免疫的淋巴细胞： 具有合成分泌抗体的功能 但不能在体外生长。,骨髓瘤细胞：不能合成或分泌Ig。 具有在体外长期连续继代的特性。,1. 原 理,杂交瘤细胞：合成抗体、能在体外长期连续传代,2.单抗技术流程,聚乙二醇（PEG）,次黄嘌呤（H）氨基蝶呤（A）胸腺嘧啶核苷（T）,3 杂交瘤细胞的选择性培养 DNA合成的途径： 糖+氨基酸 氨基喋呤 (Aminopterin,A) TK 核苷酸 DNA 胸腺嘧啶核苷 TMP (Thymidine,T) 核苷酸前体 次黄嘌呤 HGPRT IMP (Hypoxanthine, H),（）主要试剂,融合剂：聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）,HAT选择培养基： 次黄嘌呤（H）氨基蝶呤（A）胸腺嘧啶核苷（T）,杂交瘤细胞染色体,SP2/0细胞染色体,三. 单克隆抗体的特性 高度均一性： 纯度很高的均一性抗体 高度专一性： 只对抗原分子上某一抗原决定 簇起反应 大量产生及稳定性： 杂交瘤细胞能在体内外无限繁殖 之传代,四 .单克隆抗体在医学上的应用,（一）用作诊断试剂 1. 检测淋巴细胞表面分子，区分不同分化 阶段的淋巴细胞，鉴别淋巴细胞。 2. 鉴定病原体，准确诊断传染病。 3. 用于肿瘤的诊断和分型 4. 激素类单抗用于测定体内激素含量，判 断内分泌的功能状态,（二）用作研究工具纯化抗原分析和探查抗原结构分析抗原决定簇分子的功能（三）用于疾病的治疗抗细胞表面分子单抗，用于移植排斥反应的防治抗细胞因子单抗用于自身免疫性疾病的治疗抗肿瘤单抗用于肿瘤的导向治疗,基因工程抗体(GeAb): 第三代抗体 由基因重组技术制备的抗体,称为基因工程抗体。 嵌合抗体 (chimeric Ab) 人源抗体（humanized Ab) 双特异性抗体（bispecific Ab) Fab/ScFV（single chain FV fragment) 单域抗体（single chain Ab),本章小结,几幅图：几个概念：抗体，单克隆抗体，多克隆抗体，免疫球蛋白，抗原结合部位，ADCC，Fc，Fab ，CDR，中和作用(毒素和病毒)，中和抗体几个难点：抗体的抗原性，五大类抗体的理化特性及其生物学作用。,单体结构,复习思考题,一、名词解释:1. Ab/Ig/SIg 2. 功能区