第四章 抗体制药part2.ppt

第二节单克隆抗体及其制备,抗体治疗疾病的机制,中和作用导向作用拮抗作用ADCCCDCAgonist,第二节单克隆抗体及其制备,抗体治疗疾病的机制,第二节单克隆抗体及其制备,抗体的治疗应用,抗肿瘤抗感染抗器官移植排斥反应治疗自身免疫性疾病和变态反应性疾病,第二节单克隆抗体及其制备,抗体药物迅速发展的主要障碍,1.免疫原性,降低单克隆抗体的免疫原性人体免疫系统对鼠源蛋白的排斥反应抗体人源化是解决问题的唯一途径,2.分子量大,降低单克隆抗体分子量，增加组织通透性,第二节单克隆抗体及其制备,单抗研发的演变历程,第二节单克隆抗体及其制备,杂交瘤制备人单抗的问题：染色体易丢失、抗体分泌不稳定,第二节单克隆抗体及其制备,单克隆抗体人源化的改进,鼠抗体人源化（人-鼠嵌合、改型抗体）小分子抗体单价（Fab、单链、单域、超变区多肽）多价（Diabody，Triabody，Minibody）特殊类型抗体（双特异性抗体、细胞内抗体、抗原化抗体、免疫脂质体）抗体融合蛋白（免疫粘连素、免疫毒素、催化抗体）人源抗体（噬菌体抗体库、转基因小鼠）人-人抗体,一、人-鼠嵌合抗体二、改形抗体三、Fab和Fv抗体四、单链抗体五、单域抗体和分子识别单位,第三节基因工程抗体及其制备,第三节基因工程抗体及其制备,第三节基因工程抗体及其制备,二硫键连接的4条多肽链重链（H），轻链(L)可变区(V区)，恒定区（C区）互补决定区（CDR）C区决定了Ig分子的一种抗原性（免疫原性）CDR区决定抗体活性,第三节基因工程抗体及其制备,第三节基因工程抗体及其制备,第三节基因工程抗体及其制备,一、第一代的抗体人源化-嵌合抗体,将鼠单克隆抗体（MAb）的可变区和人抗体的恒定区组成嵌合由于这两部分在空间结构上相对独立，其独特的抗体亲和力保持得很好，但因鼠单抗可变区的存在，应用时仍有较强的HAMA反应。,第三节基因工程抗体及其制备,二、第二代的抗体人源化-改型抗体,在嵌合抗体的基础上进一步将鼠单克隆抗体（MAb）可变区中相对保守的FR（frameworkregion）替换成人的FR，保留与抗原结合的CDR（complementarydeterminantregion）部位（即CDR移植）,第三节基因工程抗体及其制备,小分子抗体,上述的人源化抗体属完全的抗体分子。通过基因重组技术，可以在保持原有抗原结合活性的基础上，把完整的抗体分子改造成较小的分子，称为小分子抗体。根据其价数的不同分为单价小分子抗体及多价小分子抗体两种。,第三节基因工程抗体及其制备,三、Fab抗体和Fv抗体,Fab抗体：Fab段由重链V区及CH1功能区与整个轻链以二硫键形式连接而成，主要发挥抗体的抗原结合功能。Fab抗体相对分子量只有完整lgG的1/3。Fv抗体：由VH和VL组成的具有完整抗原结合位点的最小抗体片段，表现出与完整抗体相似的结合活性，它的发现推动了抗体的体外重组技术的发展。,第三节基因工程抗体及其制备,第三节基因工程抗体及其制备,第三节基因工程抗体及其制备,四、单链抗体,单链抗体（singlechainFv，scFv）是由VH和VL通过连接肽（接头）重组并表达而成的另外一种小分子抗体，是具有亲代抗体全部抗原结合特意性的最小功能结构单位。在此基础上，可与其他效应分子构建成多种具有新功能的抗体分子，是构建免疫毒素和双特异性抗体等的理想而基本的元件。,第三节基因工程抗体及其制备,四、单链抗体,优点：分子小，仅为完整单体免疫蛋白分子的1/6，容易进入组织，因而可用于肿瘤的诊断和治疗；因其为单链，易于进行分子改造，如与毒素等拼接成为免疫毒素，可以直接杀伤靶细胞；3.体内半衰期短，免疫原性低。,第三节基因工程抗体及其制备,四、单链抗体,缺点：稳定性仍较低，这主要是由于scFv分子内VH和VL间相互作用较弱，不足以完全抵消分子间的作用力，因而易凝集形成scFv二聚体和多聚体；功能单一，仅能与一种抗原特异性结合；亲和力低，稳定性较差，体内清除过快。,第三节基因工程抗体及其制备,第三节基因工程抗体及其制备,五、单域抗体,抗体与抗原的结合主要是由lg的V区决定，因此只含V区基因片段的小分子抗体，即只有VH或VL一个功能结构域，也能保持原克隆抗体的特异性。这种小分子的抗体片段就称为单域或单区抗体，其分子量仅为整个lg分子的1/12，故称之为小抗体。,第三节基因工程抗体及其制备,第三节基因工程抗体及其制备,识别单位,抗体抗原的结合是经过互补决定区（complement-arydeterminingregin，CDR）而实现的。因此，CDR是构成抗原抗体的最小结构单位，根据这一特点，可以设计出那些在抗原识别及亲和力方面有重要意义的CDR多肽，直接用于诊断或治疗，可望获得理想的结果。这种只含有一个CDR多肽的抗体，称为超变区多肽（hypervariablereginpolypeptides，HRP），亦称为最小识别单位（minimalrecognitionunit，MRU）。,第四节多功能抗体及其制备,一、双功能抗体二、多功能抗体三、抗体融合蛋白,一、双功能抗体,双功能抗体就是双特异性单链抗体（bispecificsingle-chainFvs，bisFvs）。Holliger于1993年将抗A抗原抗体的轻链可变区基因（VLA）与抗B抗原抗体的重链可变区（VHB）通过短肽连接子连接构建成双链抗体的表达质粒，表达后形成双特异性抗体，绝大多数是在大肠杆菌中以分泌形式表达的。将两条不同来源的scFv组合成具有两种不同抗原结合特征的新型抗体即为双特异单链抗体。,第四节多功能抗体及其制备,二、多功能抗体,近年来，在scFv的基础上，可以把两个或两个以上的scFv重组在一起，由此可制备成多价小分子抗体即微型抗体（简称多价微抗）。其中包括双链抗体（dia-body），三链抗体（tribody），微型抗体（minibody）及四链抗体（tetrabody）等。,第四节多功能抗体及其制备,双链抗体（diabody）,制备方法,第四节多功能抗体及其制备,化学交联法粘性蛋白结构域融合法接头长度控制法,微型抗体（minibody）,第四节多功能抗体及其制备,通过基因工程的手段采用不同的接头把单链抗体（VL-VH）的VH结构域与IgG的CH3结构域融合，形成VL-CH3的结构，称之为微型抗体（minibody）。此种抗体合成后通过CH3结构域形成稳定的二聚体形式，发挥其双价微抗的作用。,三链抗体（triabody）,第四节多功能抗体及其制备,在制备单链抗体时，当接头的长度为2个或2个的以下氨基酸残基时，或者直接把VH结构域的N末端与VL结构域的C末端相连，通过非共价键而形成的三聚体，称为三链抗体，接头长度在312个氨基酸残基时，则形成双链抗体。,表达的抗体分子片段,第四节多功能抗体及其制备,双特异性抗体（BfAb）,第四节多功能抗体及其制备,天然lg是由两个完全相同的VL和VH区域构成，该区域是特异性识别并结合抗原的关键部位。而经人工设计构建的双特异性抗体（BsAb）则由两个不同的抗原结合位点组成，可同时与两种不同的抗原决定簇结合，并可将其偶联的药物、酶或放射性核素等导向到靶部位，这种具有双价双特异性的抗体又称为双功能抗体（bifunctionalantibody，RfAb）。,三、抗体融合蛋白,第四节多功能抗体及其制备,抗体的一部分被非抗体序列替代，所形成的融合蛋白具有新的特性，称之为抗体融合蛋白。构建抗体融合蛋白的基本原则：将第一个蛋白的终止密码子删除，在接上带有终止密码子的第二个蛋白基因，即可实现两个基因共表达。,三、抗体融合蛋白,第四节多功能抗体及其制备,酶-抗体型偶合蛋白在药物治疗中应用前景广阔，它可在靶向位置上将前提药物转化成有效的药物，从而避免了对正常组织的损害，这种方法成抗体介导的酶前体药物治疗。（前体药物是指该药物需在体内经特定酶催化后才显示活性的物质）。抗体和酶的融合蛋白定位在肿瘤部位后再给予前提药物，其优点是提高了肿瘤区域的药物浓度，降低了对正常细胞的毒性。,第四节多功能抗体及其制备,根据构建方式的不同，抗体融合蛋白主要分为两种形式:Fc融合蛋白（FcFusionprotein，FcFP）由抗体的Fc段与某些具有特定功能的蛋白结构融合而成。如CD4免疫粘附素（immunoadhesin）就是由抗体的Fc段与2个CD4分子的lg同源区重组而成。抗原结合融合蛋白（antigen-Bindingfusionprotein，ABFP）由具有抗原结合功能的抗体结构与其他功能蛋白融合而成。如免疫毒素，抗体部分主要包括嵌合抗体、单链抗体形式。,第四节多功能抗体及其制备,特殊类型抗体一、细胞内抗体细胞内抗体柱要是指在细胞内合成并作用于细胞内组分的抗体，亦称内抗体（intrabody）。目前细胞内抗体的研究主要集中在单链抗体上，在scFv的C端或N端插入其他靶向信号（targetingsignals），如分泌、核定位信号、线粒体定位信号和内质网滞留信号等，从而进行检测、识别、发挥特定功能。,第四节多功能抗体及其制备,细胞内抗体的应用：由于细胞内抗体具有高度亲和力及选择结合特性，因而可通过多种机制调控细胞的生理过程及代谢。主要为：,分子功能的研究下调生长因子受体的表达抑制细胞内癌蛋白的活性抑制病毒复制,第四节多功能抗体及其制备,细胞内抗体广泛应用前存在的问题：基因转移系统的建立，特别是体内基因转移时基因的靶向传递的问题，使细胞内抗体基因导入充足数量的靶细胞