荧光原位杂交技术

荧光原位杂交技术,荧光原位杂交技术,第一节 原位杂交技术简介第二节 荧光原位杂交技术的应用第三节 原位杂交操作步骤第四节 影响杂交的因素第五节 荧光原位杂交技术的新进展,原位杂交技术简介in situ hybridization,原位杂交技术的基本原理是根据核酸分子碱基互补配对的原则， 将有放射性或非放射性标记的外源核酸（探针）与经过变性后的单链DNA互补配对，结合成专一的核酸杂交分子，再经一定的检测手段将待测核酸在染色体、细胞或组织上的位置显示出来的一项技术。该技术最早是Pardue and Gall (1969)和John et al. (1969)分别独立建立起来的。当时使用的放射性标记探针，利用放射自显影检测一些高度重复序列DNA在染色体上的定位，此后原位杂交技术日益成为生物医学领域的一种十分重要的技术手段。尽管放射性标记探针灵敏度很高，能够检测小至几百个碱基对的DNA序列，但是由于同位素的安全问题、半衰期、信号统计等限制了此项技术的广泛应用，后来逐渐发展出了非放射性标记探针原位杂交技术。,原位杂交操作步骤,一、准备载玻片和固定材料二、染色体标本制备和预处理三、探针制备及标记四、染色体标本变性五、杂交六、杂交后洗脱七、免疫细胞化学检测八、荧光显微镜观察及显微摄影,染色体标本制备,预处理,1、RNA酶处理 1） 每张玻片加100 l 100 g/ml RNase A (in 2x SSC) 37处理1小时 2）用2x SSC洗35min 3）70%，80%，100%乙醇系列脱水，每级5分钟2、胃蛋白酶处理 1） 0.005-0.02% pepsin（10 mM HCl） 37处理10 min 2） 1PBS洗25min 3） 1PBS，50 mM MgCl2处理5min 4） 1PBS，50 mM MgCl2,1%甲醛固定10min 5） PBS洗涤并脱水,气干,非放射性标记法,直接法荧光素（fluorescein）或其他荧光染料 间接法地高辛（digoxigenin）生物素（biotin）,1. 随机引物法2. 缺口平移法3. PCR法4. 寡核苷酸末端标记法5. 直接在探针3或5端合成,1. 0.5ml离心管中加入1ug探针DNA,加水置体系为16ul2. 沸水浴中变性10min, 马上置于冰水中3. 加入4ul DIG-High Prime(5x buffer; 50% glycerol;1 U/l Klenow enzyme; 5x random primer mix; 1 mM each of dATP, dCTP, and dGTP; 0.65 mM dTTP; and 0.35 mM DIG-11-dUTP) 4. 混匀离心，置于37温育1小时20小时5. 65 处理10min终止反应,染色体标本变性,共变性杂交液加到标本上封片，置80 烘箱中10分钟分别变性70%甲酰胺，2xSSC 70 处理2分钟70%，85%，100%冷乙醇系列脱水，空气干燥,1. 杂交液(50% 去离子甲酰胺, 2x SSC, 10% 硫酸葡聚糖, 50 mM 磷酸钠; pH 7)中加入标记的探针，每10ul杂交液含50ng探针2. 探针95 变性5分钟，置冰水中10分钟3. 10ul杂交液加到标本上，盖盖玻片并封片4. 湿盒中37杂交过夜,杂交,1. 2x SSC, 50%甲酰胺45 洗3x5min2. 2x SSC 37洗2x5min3. TNT buffer 100 mM Tris-HCl (pH 7.5), 150 mM NaCl, 0.05% Tween 20 37洗1x5min,杂交后洗脱,1. TNT buffer冲洗2. TNB buffer100 mM Tris-HCl (pH 7.5), 150 mM NaCl,0.5% blocking reagent3. Anti-DIG-荧光素(2 g/ml, in TNB)3730min4. TNT buffer冲洗3x5min5. 乙醇系列脱水,气干6. DAPI染色10min7. 加Vectashield封片,荧光显微镜下观察并照相,免疫细胞化学检测,影响杂交的因素,一、影响杂交的主要因素温度、pH、单价阳离子浓度、甲酰胺二、其他因素探针长度、探针浓度、硫酸葡聚糖、洗脱严谨度三、标准杂交条件,FISH技术的应用,基因定位染色体结构变异(异位、缺失、重复)研究染色体物理作图疾病及产前诊断外源基因检测多倍体起源进化研究分子核型研究染色体（质）空间结构研究,荧光原位杂交技术新进展,M-FISH，armFISH(42-color M-FISH), SKYBAC-FISH, YAC-FISHFiber-FISHPRINS ( Primed in situ DNA synthesis)引物原位DNA 合成技术IS-PCR (in situ polymerase chain reaction) 原位PCRGISH(Genome in situ Hybridization)基因组原位杂交Immuno-FISH3D-FISHQ-FISH（Quantitative-FISH），Flow-FISHT-FISH（Tissue-FISH）or (Telomere-FISH)RNA-FISH,Chromosome Lab,5种荧光素联合标记人类24条染色体荧光素 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 X YFITC Cy3 Cy3.5 Cy5 Cy7 ,光谱核型分析（spectral karyotyping ,SKY),SKY是另一种M-FISH,实验操作和结果与M-FISH相似。原始图像利用干涉仪产生干涉信号，再采用高性能CCD数码相机进行拍摄，得到一组不同光程差的干涉图像。 再将所得数据做FFT(快速傅立叶变换), 得到每一点的光谱信息。 通过分析光谱信息，发现原始图像的信息。,Chromosome Lab,干涉仪,镜子,收集光线标本,发射光谱,CCD相机傅立叶转换,分析光谱信息,通过光谱分析准确分析A图中的色彩分为相近的三种染色体（C图）,Chromosome Lab,该技术操作简单，只需进行一次杂交，一次拍摄，而传统M-FISH在拍摄过程中要变换多次滤光片。该技术灵敏度高，由于摒弃了传统M-FISH采用的以滤光片为基础的成像技术，在拍摄过程中全光谱通过，因此光通过量大大提高，从而提高灵敏度。分析准确率高 ，整个分析基于光谱信息，所以准确率极高，即使是染色体末端的微弱信号，也同样可以采集到。,Chromosome Lab,利用SKY技术，准确判断出7号染色体和12号染色体之间的交叉易位。,Chromosome Lab,G带分析得到一条marker染色体无法确认起源，用SKY确定来源于18号。,Chromosome Lab,Fiber-FISH DNA纤维的制备是先将单细胞悬浮液涂在载玻片上，然后利用碱变性剂或 EDTA-SDS缓冲液等化学方法将染色体的结构破坏，让DNA分子与复合的蛋白质分离而形成游离的DNA纤维，再以这种失去空间结构的线性DNA分子作为靶DNA的载体进行原位杂交，使分辨率和灵敏度都有了很大的提高。,Chromosome Lab,在不同靶DNA上荧光原位杂交技术的比较靶DNA结构 分辨率水平 可检测DNA 优点和缺点 序列范围中期染色体 13Mb 1Mb 保持染色体结构，切片容易制备 分辨水平低，识别染色体困难前期染色体 200Kb 200Kb 保持染色体结构,分辨水平居中 切片不易制备,识别染色体困难拉长的中期染色体 200Kb 200Kb 保持染色体着丝点端粒结构，分辨 率水平居中，拉长染色体不均匀粗线期染色体 100Kb 100Kb 保持染色体结构，识别染色体可能， 分辨率水平较高，切片不易制备间期细胞核 50Kb 50Kb-2mb 分辨