“产淀粉酶菌株的筛选”设计方案

产淀粉酶（-淀粉酶）细菌菌株筛选一、 实验目的：1. 掌握从环境中采集样品并从中分离纯化某种微生物的完整操作步骤。2. 巩固以前所学的微生物学实验技术。3. 学习淀粉酶活性的测定方法。二、 实验原理：1. -淀粉酶是一种液化型淀粉酶，它的产生菌芽孢杆菌，广泛分布于自然界，尤其是在含有淀粉类物质的土壤等样品中。2. 从自然界筛选菌种的具体做法，大致可以分成以下四个步骤：采样、富集培养、初步筛选、分离纯化和性能测定。a) 采样：即采集含菌种的样品采集含菌样品前应调查研究一下自己打算筛选的微生物在哪些地方分布最多，然后才可着手做各项具体工作。在土壤中几乎各种微生物都可以找到，因而土壤可说是微生物的大本营。例如厨房土壤、面粉加工厂和菜园土壤中淀粉的分解菌较多。b) 富集培养：富集培养就是在所采集的土壤等含菌样品中加入某些物质，并创造一些有利于待分离微生物生长的其他条件，使能分解利用这类物质的微生物大量繁殖，从而便于我们从其中分离到这类微生物。c) 初步筛选：i. （选择培养基）初筛使用选择培养基对菌种进行培养，通过培养基的特殊成分，来筛选出目的菌种，从而进行培养。ii. （鉴别培养基）初筛利用鉴别培养基，通过添加一些特殊的试剂或成分来鉴别出目的菌种，从而筛选出来并对其进行培养。d) 分离纯化：通过上述的筛选只能说我们要分离的目的菌种已经存在，但还要把夹杂在其中的杂菌除去，从而得到纯种的菌落。纯种分离的方法很多，主要有：平板划线分离法、稀释分离法、单孢子或单细胞分离法、菌丝尖端切割法等。e) 性能测定：分离纯化得到的菌种之后，所分得的菌种是否具有实验所要求的性能，还必须要进行性能测定后才能决定取舍。三、 实验材料：1. 培养基配制：a) 培养基按以下比例配制后，加蒸馏水调至100%；b) 富集培养基：可溶性淀粉1%、蛋白胨1%、葡萄糖0.5%、NaCl 0.5%、牛肉膏0.5%、pH7.0；c) 分离培养基：玉米粉2%、黄豆饼粉1.5%、琼脂粉0.8%、CaCl 0.02%、MgSO4 0.02%、NaCl 0.25%、K2HPO4 0.2%、柠檬酸钠0.2%、硫酸铵0.075%（溶解后加入）、Na2HPO40.2%、pH7.0。2. 主要试剂和溶液的配制：a) 2%淀粉溶液：准确称取淀粉2g溶于100ml 0.1mol/L pH5.6的柠檬酸缓冲液中。b) 0.1mol/L的柠檬酸缓冲液、pH=1.0的盐酸c) 1%的3，5-二硝基水杨酸：精确称取1g3，5-二硝基水杨酸，溶于20ml 2mol/L氢氧化钠溶液中，加入蒸馏水50ml，再加入四水酒石酸钾钠30g，待溶解后用蒸馏水定容100ml，盖紧瓶塞，隔绝CO2。d) 0.1%葡萄糖溶液：准确称取80烘干至恒重的无水葡萄糖0.1g，去离子水溶解后定容至100ml。e) 0.1%标准麦芽糖溶液：称取麦芽糖100mg，用蒸馏水溶解并定容至100ml。四、 实验方法：1. 采样与稀释：a) 从实验楼前的小树林中采集土样，称取5g土样，放入装有 45mL无菌水的三角瓶中, 震荡 20m in后静置 5min。然后对其进行浓度梯度稀释到10-6, 分别稀释到10-4、10-5、10-6浓度下。2. 富集培养：a) 从上述土壤稀释液中各取1 mL注入无菌培养皿中，然后倒入灭菌并融化冷却至50左右的富集培养基，小心摇动冷凝后，倒置于37保温箱中培养24小时。3. 初步筛选：a) 培养24小时后，取出平板，向平板中注入1滴革兰氏碘液，因淀粉遇碘变蓝色，如菌落周围有无色透明圈，说明该菌能分解淀粉，即该菌株可以产生淀粉酶。通过影印法或点种法将可以产生淀粉酶的菌株接种到相同的无菌培养中，重复操作进行培养。4. 分离纯化：a) 初筛所得的菌落中选择菌落周围透明圈和菌落直径之比值较大的菌落，进行划线分离。将划线分离后的培养皿放入37 培养箱中培养24小时。5. 性能测定：a) 标准曲线的制作：i. 取7支20ml预先洁净灭菌干燥的试管，编号，加入试剂见表1。每个浓度做3个平行样本。摇匀，至沸水浴中煮沸5min。取出后流水冷却，加蒸馏水定容至20ml，以1号管作为空白调零点，在520nm的波长下比色测定吸光度值，并建立通过吸光度值求麦芽糖含量的回归方程。表1 淀粉酶标准曲线的制作试管号麦芽糖标准液（ml）麦芽糖含量（mg）蒸馏水（ml）3，5-二硝基水杨酸（ml）1002.02.020.20.21.82.030.60.61.42.041.01.01.02.051.41.40.62.061.81.80.22.072.02.002.0b) 酶活力测定：i. 首先制备待测粗酶液：取培养好菌株的分离培养基进行4000rpm离心20min，并收集上清液即为待测粗酶液。ii. 取20ml预先洁净灭菌干燥的具塞刻度试管，编号。并按步骤操作：取粗酶液1.0ml加2%的可溶性淀粉1ml，蒸馏水3ml，于60 水浴中预热5min加0.1ml/l柠檬酸缓冲液（pH6.0）1ml于60 水浴中保温30min加3，5-二硝基水杨酸1.5ml，沸水浴中煮沸5min，迅速冷却，加蒸馏水定容至20ml。iii. 空白对照：取粗酶液1.0ml，加入pH1.0的