TAIL-PCR原理及应用.ppt

TAILPCR一种DNA侧翼序列分离技术,在分子生物学研究中,基因克隆和分子杂交的探针制备等操作常需分离与已知DNA序列邻近的未知序列。热不对称交错PCR(thermalasymmetricinterlacedPCR,TAIL-PCR)是一种用来分离与已知序列邻近的未DNA序列的分子生物学技术。在分子生物学研究领域中,利用该技术分离出的DNA序列可以用于图位克隆、遗传图谱绘制的探针,也可以直接测序。该技术技术简单易行,反应高效灵敏,产物的特异性高,重复性好,能够在较短的时间内获得目标片段,已经成为分子生物学研究中的一种实用技术。,介绍,结构,1，TAILPCR原理2，TAILPCR引物设计3，TAILPCR反应条件4，TAILPCR优缺点及其优化5，TAILPCR应用,TAILPCR以基因组DNA作为模板，利用依照目标序列旁的已知序列设计的3个较高退火温度的嵌套特异性引物(specialprimer,SP)，和一个较短且Tm值较低的随机简并(arbitrarydegenerate,AD)引物组合，通过3轮具热不对称的温度循环的分级反应来进行PCR扩增，获得已知序列的侧翼序列。,原理,目的片段,第1次PCR反应由5次高特异性反应、1次低特异性反应、15次热不对称的大循环构成。通过5次高特异性的反应,使sp1与已知的序列退火并延伸,提高目标序列的浓度。1次低特异性的反应使简并引物结合到较多的目标序列上,随后进行15次TAIL循环。经过上述反应得到了不同浓度的3种类型的产物:特异性产物和非特异性产物(型和型),TAIL-PCR一般分为3次反应,第2次反应将第一级反应的产物稀释1000倍作为模板,通过15次热不对称的大循环,使特异性的产物被选择性地扩增,而非特异性的产物被压制到极低的含量。,第3次反应又将第2次反应的产物稀释1000倍作为模板,通过15次热不对称的大循环。,通过上述3次PCR反应可获得较高含量的与已知序列邻近的目标序列。,、分别为TAIL2PCR反应中第2次和第3次反应的产物,TAIL2PCR产物分析,在多数情况下,第1次反应有较多的非特异性产物特异性引物在第1次反应中一般不能扩增到可被检测的水平,因此可以省去第1次反应产物电泳分析，仅仅检测第2次和第3次反应的产物来获得特异性的目标片段。取第2次反应产物和第3次反应产物成对点样。由于特异引物是嵌套的,因此特异性扩增的特点是第3次反应产物小于第2次反应产物。由于AD引物在特异性引物的下游有多个退火位点,同一目标序列有时会产生一个以上不同长度的特异性片段。,TAIL-PCR引物设计,和一般的PCR反应相比，TAIL-PCR反应对引物的要求较高，引物的设计很是重要。特异性引物和简并引物的选择直接影响扩增的效果。,特异引物设计3个嵌套的特异性引物长度一般在2030bp之间，Tm值一般设为5868。SP1、SP2和SP3之间最好相距100bp以上以便在电泳时更容易区分3轮PCR产物。简并引物设计简并引物是按照物种普遍存在的蛋白质的保守氨基酸序列设计的，相对较短，长度一般是14bp左右，Tm值介于3048之间。AD引物是否最佳与它的简并度、引物长度和核苷酸序列组成有很大关系。为了更好的与目标序列退火：首先，尽量选择简并度低的氨基酸区域作为引物设计区；其次，充分注意物种对于密码子的偏好性，选择该物种使用频率高的密码子，以降低引物的简并性；最后，尽量避免3末端的简并。,TAIL-PCR反应条件,5次高特异性反应,1次低特异性反应,15次热不对称的大循环,15次热不对称的大循环,15次热不对称的大循环,Table1CyclesettingsusedforTAIL-PCR,TAIL-PCR反应条件,每次使用不同SP引物,第2、3次为前一次稀释1000倍,TAIL-PCR技术优缺点,TAIL-PCR方法直接通过3轮PCR反应来得到目的片段，省去了诸如：酶切、连接、加尾等传统的基因克隆方法中的繁琐步骤；而且TAIL-PCR方法又克服了常规PCR不能对已知DNA序列侧翼的未知序列进行扩增的缺点，能快速地分离到目标序列。,优点：(1)操作简便，省时，只要设计好引物,即可以用基因组DNA作模板直接筛选到目标序列。(2)成本低，TAIL-PCR只需要设计几个嵌套特异引物和简并引物即可，大大降低了成本(3)高特异性，用短的简并引物和长的特异性嵌套引物相组合,通过不对称的温度循环和分级反应,使反应体系有利特异引物的扩增。(4)高灵敏性，使用任何一个AD引物,在60%80%的反应中能够产生特异性产物。运用不同的AD引物就能够有效地扩增到目标片段。(5)快速。整个TAIL2PCR反应循环能够在1d内完成,可以快速地获得目标片段。,缺陷：(1)反应条件设置要求精细，因为TAIL-PCR是3轮连续的嵌套的反应。若是其中一轮出现失误，将会直接影响下一循环的工作。(2)TAIL-PCR反应需要较多的引物组合，因为不同的AD引物具有不同的结合位点。(3)TAIL-PCR反应不是每次都有阳性结果。因为AD引物存在有限的结合位点，在个别侧翼序列的扩增中，即使使用不同的简并引物也难以获得阳性结,优化优化TAIL-PCR反应的一些环节，可大大增加反应产物的特异性,优化1，3次循环中增设不同的退火温度，设计特异引物时选择合适的Tm，这样会更有利于特异目的片段的富集优化2，延长3次PCR循环中的变性时间和延伸时间，变性时间延长到了，有利于DNA彻底解链；延伸时间延长，更有利于较长的侧翼序列的获得。优化3，热不对称PCR循环次数适当增加，或不对对称设置为3:1。优化4，简并引物可以做一个混合物，将几个引物组合在一起，在反应时混合物中各个引物依然维持原来的浓度，提高目标条带扩增的机率。,TIAL-PCR的应用,1.根据已知的基因或分子标记连续步移，获取人、动物和植物的重要调控基因，可以用于研究结构基因的表达调控。如分离克隆启动子并对其功能进行研究；2.获取