基因的序列分析

分子生物学硕士理论课教学安排：,基因序列分析的基本策略,房明丽分子生物学教研室联系方式：,Strategies for analyzing gene sequence,基因的序列组成分析（一级结构）,基因的含量的分析,基因的修饰水平分析（甲基化）,测序,Northern Blot,实时PCR,RT-PCR,基因序列分析的基本策略,限制性片段长度多态性分析,核酸分子杂交,焦磷酸测序,1. DNA序列测定,2. 限制性片段长度多态性分析,3. 核酸分子杂交,（一）基因的序列组成分析,1. DNA序列测定（DNA sequencing）,基因的一级结构是指脱氧核苷酸的排列顺序，解析一级结构最精确的技术就是DNA测序.,（1）Sanger双脱氧末端终止法,单脱氧核苷酸（dNTP),背景知识,ATCG,3-5磷酸二酯键,双脱氧核苷酸(ddNTP),不能与下一个脱氧核苷酸结合!,（1）Sanger双脱氧末端终止法,背景知识,在PCR反应体系中，如果只加入一条引物是什么样子的结果？,单引物只能扩增单链DNA扩增的包含引物的单链DNA,不对称PCR (asymmetric PCR)是用不等量的一对引物，PCR扩增后产生大量的单链DNA(SSDNA).,（1）Sanger双脱氧末端终止法,DNA pol,原理,合成一系列长短不同的以G为结尾的DNA片段,测序PCR反应体系,原理,（1）Sanger双脱氧末端终止法,（1）Sanger双脱氧末端终止法,原理,Polyacrylamide Gel Electrophoresis ( PAGE)聚丙烯酰胺凝胶电泳,泳道上长短不同的寡核苷酸片段在变性聚丙烯凝胶中泳动的距离不同,MOVIE,* 以不对称PCR技术为中心，* 利用双脱氧核苷酸终止新链的延伸，* 从而获得在任何一个核苷酸上随机终止的一系列长度不同的DNA片段。*变性聚丙烯凝胶电泳分辨仅差一个核苷酸长度的DNA片段,（1）Sanger双脱氧末端终止法,小结,缺点：,（1）Sanger双脱氧末端终止法,手工测序,泳道间迁移率有差异，对测序的精确性有一定的影响,放射自显影条带较宽，读序列困难,全自动激发荧光DNA测序,（2）全自动激光荧光DNA测序,原理基于sanger双脱氧法，第一代测序技术，应用十分普遍。实现制胶，进样，电泳，检测数据分析全自动化。测序长度可以超过1000bp，准确率可达到99.999%,荧光标记四种ddNTP，只需做一个反应。,。,四色荧光法,赋予DNA片段4种不同的颜色,一个样品的4个反应产物可在同一泳道内电泳,自动化的毛细管电泳,DNA测序仪：其实它就是将测序PCR产物进行PAGE，电泳时激发出四色荧光，并进行软件分析。,四色荧光法,基于Sanger原理的DNA测序法可以分析基因的一级结构序列。,分析人工重组的基因 分析鉴定基因和基因组 分析基因的定点突变,长度可达到1000bp,可检测未知基因,每次只能检测一个样本,（3）焦磷酸测序法,焦磷酸测序是一种可行的方法,特点：测序长度短于sanger法，定量测序，操作简单，结果可靠。,单核苷酸多态性位点（SNP)分析,等位基因频率测定,细菌和病毒等微生物分型鉴定,疾病相关基因序列的突变位点,基因CpG甲基化的分析,焦磷酸测序是对短到中等长度的DNA序列样品进行高通量的、精确和重复性好的分析的技术,（3）焦磷酸测序法,背景知识：什么是焦磷酸？,提问:先回忆一下什么是ATP? ATP是怎么水解的？,ATP 水解实际上是指ATP分子中高能磷酸键的水解。,ATP,ADP +磷酸盐,分子简式：APPP,AMP+磷酸盐,AMP+2分子磷酸盐（PP),焦磷酸,（3）焦磷酸测序法,焦磷酸测序实际上就是酶促反应测序技术,背景知识：先认识一下焦磷酸测序种所用到,ATP硫酸化酶,荧光素酶,三磷酸腺苷双磷酸酶,DNA聚合酶,ATP 硫酸化酶 PPi+ 5磷酸化硫酸腺苷 （APS) ATP 荧光素酶，ATP荧光素 氧化荧光素,两种特殊底物,四种酶：,APS, 荧光素,（3）焦磷酸测序法,原理,双磷酸酶,荧光素酶,硫酸化酶,APS+,荧光素+,DNA聚合酶,第一步：加入测序引物，相关酶，底物，和其他试剂,第二步：每次加入一种dNTP,如果结合，则会产生一个焦磷酸（PPi）,第三步：硫酸化酶转化PPI为ATP, ATP使荧光素酶发出荧光。（产生的荧光强度与结合的核苷酸成正比）,第四步：多余的dNTP被降解，开始新一个循环。,（3）焦磷酸测序法,测序原理,看一下视频,（3）焦磷酸测序法,结果分析,每次向反应体系中加入一种dNTP,相应位置的峰代表该种dNTP的掺入情况峰高与掺入的核苷酸数量成正比1分子dNTP掺入，释放出1分子的ppi，生成1分子的ATP, 产生单位强度的光信号,序列：TGGCCGGGTCACGAGGCCCTA,（3）焦磷酸测序法,特殊注意,dATP需要选择替代物 dATPS 。dATPS不是荧光素酶的底物DNA聚合酶对dATPS的催化效率比对dATP的催化效率高。,（3）焦磷酸测序法,技术流程,多孔测序，一次可检测96个样本,（3）焦磷酸测序法,应用,（举例说明1： 应用焦磷酸测序法检测纯合子和杂合子）,SNP 182A/G,（3）焦磷酸测序法,应用,（举例说明： 应用焦磷酸测序法检测SNP位点）,单核苷酸多态性(SNP),基因组上单个核苷酸的变异,一般而言, 变异频率大于1 %的单核苷酸变异可称为SNP.,人类基因差异小于1%，但是人类的表型及对疾病的易感性差异很大，都可能与SNP相关。,在人类基因组中大概每1000 个碱基就有一个SNP.,1. EFGR过表达于大量的肿瘤组织，在肿瘤的生长，分化种起着重要的作用。,2. 抗EFGR单克隆抗体具有良好的抗肿瘤活性。,3. 抗EFGR单克隆抗体治疗肿瘤时个体差异明显。,如何预测这种个体差异，是目前抗EGFR肿瘤治疗时面临的一个首要问题。,K-ras基因突变致使细胞内KRAS蛋白持续活跃从而导致抗EGFR的抗体耐药,K-ras突变型患者并不能从抗EGFR治疗中获益,反而徒增不良反应危险和治疗费用,检测患者细胞内KRAS基因的状况可以预测该患者对特定药物的临床反应；,KRAS基因突变主要发生在密码子12，13上,密码子12/13发生变异的患者,应用,（举例说明： 应用焦磷酸测序法检测DNA甲基化）,5甲基胞嘧啶 在亚硫酸盐的作用下变成胸腺嘧啶,焦磷酸测序法检测DNA甲基化,焦磷酸测序可在一次检测中快速定量一个或多个甲基化位点,焦磷酸测序技术可检测宫颈癌中UTF1启动子区域甲基化水平,1. DNA序列测定,2. 限制性片段长度多态性分析,3. 核酸分子杂交,（一）基因的序列组成,2. 限制性片段长度多态性分析 (Restriction fragment length polymorphism ,RFLP),DNA多态性,在人类基因组中，平均约200对碱基可发生一对变异，称为中性突变(即不引起生物体的表型的改变)，它导致个体间核苷酸序列的差异。,限制性片段长度多态性,DNA多态性如发生在内切酶识别位点上，酶解该DNA可产生长度不同的片段。,RFLP原理：,由于DNA变异，产生新的酶切位点或原有的酶切位点消失。 用限制性核酸内切酶消化时，产生不同长度或不同数量的片段,RFLP应用举例,镰刀性贫血病的诊断,原理,该病由球蛋白基因一个核苷酸突变（由GAG变成GTG)导致的，这个核苷酸改变也正好导致一个限制性酶切位点改变。杂合体经酶切产生带型差异，识别该位点。,1. DNA序列测定,2. 限制性片段长度多态性分析,3. 核酸分子杂交,（一）基因的序列组成,3. 核酸分子杂交（Nucleic acid hybridization）,具有互补序列的两条核酸单链 ，在一定条件下，按碱基互补配对的原则形成双链的过程。,提问：什么是分子杂交？,DNA,RNA,RNADNA,根据分子杂交的原理，利用一条已知的核酸序列，用这条核酸量可以检测出有没有与其互补的碱基序列。被标记上可检测信号的、已知序列的单链核酸片段 (RNA或DNA,探针,探针是如何被标记上的？,探针的标记,同位素标记物：32P， 35S，3H非同位素标记物：生物素、地高辛、荧光素,缺口平移法,5,3,3,5,3,5,3,5,DNase,DNA 边降解边合成,DNA 合成时参入标记的单核苷酸,随机引物法,DNA 合成时参入标记的单核苷酸,将已知序列的核酸片段 (单链RNA或DNA)进行标记,使之带有特殊可检测信号，作为探针，与未知DNA或RNA单链进行分子杂交,检测未知DNA或RNA单链中，是否存在与探针序列互补的特定序列。,探针杂交过程,探针技术,2. 加入变性的探针DNA,1. 变性,3. 杂交,4. 检测杂交体,探针技术,利用核酸探针检测DNA的核酸杂交称作Southern 印迹杂交,利用核酸探针检测RNA的核酸杂交称作Northern 印迹杂交,Southern 印迹杂交,Northern 印迹杂交,斑点杂交，原位分子杂交,Southern 印迹杂交,,1975年，英国人Edwin Mellor Southern创建,制备待测 DNA 样品、标记基因探针；电泳分离待测DNA样品；待测DNA样品的变性、转膜；杂交；显色。,将电泳分离的待测基因组DNA酶切片段转移到一定的固相支持物上，然后与标记的核酸探针进行杂交的过程， 基本流程如下：,Southern 印迹杂交,,.将内切酶消化的DNA片段进行电泳分离,DNA Isolation,RE Digestion,Agarose gel electrophoresis,. 胶中的DNA经变性及中和后, 转膜,Neutralize Blot：Transfer DNA onto NC membrane,DNA is denatured by NaOH,Southern印迹基本操作过程,转膜方法（1）,毛细管虹吸法Southern转膜示意图,转膜方法（2）,电转法转膜装置示意图,将硝酸纤维素膜放入杂交袋中： 预杂交 杂交（与标记的核酸探针共孵育 ）洗膜,放射自显影后的X光底片,将硝酸纤维素膜与X-光片曝光,.检测杂交信号: 放射自显影（或显色）,. 标记的探针与DNA的杂交,琼脂糖胶,取下硝酸纤维素膜,硝酸纤维素膜,M,Southern印迹基本操作过程,Southern印迹的应用,Southern印迹杂交在产前诊断、DNA图谱分析及癌基因检测等方面有重要价值。,可将具有一定已知顺序的某基因的 DNA片段，标上放射性核素，构成核酸探针，将它通过分子杂交与缺陷的基因结合，产生杂交信号，从而把缺陷的基因显示出来，借此可对许多遗传性疾病进行诊断。,镰状红细胞贫血患者的基因诊断,突变杂合子,镰状红细胞贫血患者的基因诊断,正常的（N）的ASO探针： 5-ACT CCT GAG GAG AAG TCT GC-3 突变的（M）的ASO探针： 5-ACT CCT GTG GAG GAAG TCT GC-3,正常纯合子,突变纯合子,镰状红细胞贫血是由珠蛋白的基因发生单一碱基突变引起，正常基因的第6位密码子为GAG（编码谷氨酸），突变后为GTG（编码缬氨酸）,将电泳分离的待测RNA从琼脂糖凝胶中转移到固相支持物上，然后与核酸探针杂交，进而定性分析mRNA。,基本程序：1、RNA的电泳2、转膜: 将RNA转移到固相支持物上3、杂交:膜上的RNA的与探针的杂交4、检测杂交信号,Northern 印迹杂交,,与Southern Blot 极为相似与Southern杂交的不同,靶核酸：RNARNA电泳:甲醛变性电泳转膜：不需变性,斑点杂交（Dot Blot）,将RNA或变性DNA样品点到一张硝酸纤维素膜上，并将膜按区域划分，点多个样品，烘烤固定，然后与特定探针进行杂交。,优点：简单、快速、可同时检测多个样品,荧光原位分子杂交（FISH, Fluorescence In Situ Hybridization ）,在保持细胞基本形态的情况下（不从组织或细胞中提取核酸），用探针在细胞的原位检测靶DNA的存在情况,-Chromosome + DNA probe,-Locate specific gene on Chromosome,DNA芯片技术 (Gene chip),是指在固相支持物上直接将大量预先制备的DNA探针以显微打印的方式有序地固化于支持物表面，然后与标记的样品杂交。通过对杂交信号的检测分析，得出样品的遗传信息。,样品被标记荧光,探针被固定到固相支持物上。,高通量，自动化,正常组织,异常组织,对照组mRNA,实照组mRNA,Cy5标记mRNA,Cy3标记mRNA,等量混合,激光扫描信息分析,DNA芯片技术数据分析,DNA芯片的应用,cDNA芯片： 可用于分析肿瘤组织mRNA表达的情况。因此，可用于寻找和鉴定与疾病相关的基因。,例如，北京大学的科研人员应用基因芯片技术，发现了在前列腺癌的发生、发展中起重要促进作用的基因，从而为前列腺癌的诊断和治疗提供了新的依据。,第一部分 小 结,RT-PCR分析,实时PCR,（二）基因的量分析,Northern blot,Western blot,在mRNA水平上的分析,在蛋白质水平上的分析,1. Northern 印迹 (Northern blot),模板mRNA（template) 核酸探针（probe) 碱基互补配对,利用核酸分子杂交方法检测RNA的方法,定性分析（有 or 无）相对定量分析？,如果固定一些条件：模板mRNA来源的细胞数量操作中各个环节的准确计量模板mRNA等量上样电泳内掺照,Northern blot逐渐被RT-PCR所替代,2. RT-PCR技术,背景知识：,什么是PCR? 又叫做聚合酶链式反应，是体外特异性扩增目的基因的技术。,什么是RT-PCR? 又叫做反转录PCR，将RNA的反转录反应和PCR反应联合应用的一种技术。,PCR的原理?,PCR的基本程序： 1.模板的变性 2.引物的退火 3.新链的延伸,2530 Cycles of the above 3 steps,Taq pol，dNTPs,特异性的扩增了DNA片段 DNA片段以2n（为反应周期数）的倍数增加。,聚合酶链式反应 (PCR)的结果,RT-PCR的原理?,最后都进入平台期,RT-PCR可相对定量分析特定mRNA,内掺照: 在一个PCR反应中加两种或两种以上引物外掺照: 用等量相同模板不同引物平行进行两个或多个PCR反应,参照物：一般选择管家基因如: -actin -actin GAPDH (磷酸甘油醛脱氢酶),组成性表达多拷贝基因，mRNA量丰富可能存在假基因,如编码组蛋白基因、编码核糖体蛋白基因、编码线粒体蛋白基因、编码糖酵解酶基因,用RT-PCR相对定量检测特定基因的转录产物mRNA时一定要避免基因组的污染跨越内含子设计引物可在一定程度上解决这种问题,问：为什么选择管家基因作为参照物？,House-keeping gene,3. 荧光实时定量PCR技术,实时定量PCR技术（real-time quantitative polymerase chain reaction, real-time qPCR）是目前确定样品中DNA（或cDNA）拷贝数最敏感、最准确的方法。,常规PCR技术：对PCR扩增反应的终产物进行定性及半定量分析实时PCR技术：,通过对PCR反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测，从而实现对起始模板（DNA/cDNA)浓度的定量分析。,原理,3. 荧光实时定量PCR技术,1. TaqMan 探针法,TaqMan 探针是一种水解型杂交探针，在合成其所在的DNA链时就会发出荧光,2. SYBR Green 荧光染料掺入法,SYBR Green I 是一种与双链DNA小沟结合的荧光染料，只与双链DNA结合才能发出荧光，通过观察荧光信号强度来反应体系中双链DNA分子的量。,TaqMan 探针法,3. 荧光实时定量PCR技术,什么是TaqMan 探针？,探针分子的3端是荧光素淬灭基团,探针分子的5端是报告荧光,5 Reporter 3 Quencher,与目标序列互补,荧光基团、淬灭基团距离较近：无荧光信号！,1. 变性: 无荧光信号,Primer,5,Primer,TaqMan 探针在 PCR 各步骤中发生的变化：,2. 退火: 无荧光信号,3,5,探针与模板杂交,Hybridization,Primer,Primer,3. 延伸: DNA聚合