生化检验技术基础.ppt

生化检验技术基础与进展,上海长征医院实验诊断科于嘉屏,一、比色分析,1比色分析理论Beer-Lambert定律A=lg（I0/I）KCL或II010-KCLI0：入射光强度I：透过光强度K：常数C：溶液浓度L：溶液的厚度,（1）郎伯定律I0ItlL-dIIdl，-dIaIdl，dI/I=-adl积分ItLdI/I-adl得：ln(I0/It)-aLI00将ln改为lg，则为：lg（I0/It）-0.434aLKL令lg（I0/It）A，则AKL,（2）比尔定律AK”C（3）郎伯-比尔定律AKLC,透光率（transmittance，T，透射率）TI/I0吸光度（absorbance，A）光密度（epticaldensity，D或OD）AlgI0/I-lgTT10-A10-KCLAKCL当L用cm，C用mol/L表示，则K即称之为摩尔吸光系数，用表示。当C1mol/L，L1cm，则A。,T与A的关系透光率（T）吸光度（A）10.0000.750.1250.50.3010.250.6020.170.7700.11.0000.051.3010.012.0000.0013.000,2影响因素（1）化学因素的影响溶液中溶质可因浓度的改变而发生离解、缔合，与溶剂间的作用等原因而出现偏离比尔定律的现象。由化学因素引起的偏离，有时可控制溶液条件设法减免。此外，能产生荧光的物质也可导致偏离比尔定律。,（2）非单色光的影响比尔定律的一个重要条件是单色光，但在比色分析中常有不同波长的光同时存在。这就使吸光度发生改变，从而偏离比尔定律。,波长的选择,可见,（3）光学因素的影响散射是向空间各个方向，而使透射光减弱。反射可使光能损失，当光线通过两种不同介质时，则发生反射。当样本溶液与空白溶液的折射率有较大差异时，导致吸收值的偏差。（4）非平行光通过吸收池时，由于光线的倾斜使厚度L增大而影响测量值。,3比色法的误差,（1）仪器误差滤光片，狭缝过宽，光电池疲劳，仪器结构，散热不良。（2）方法误差（3）操作误差,比色法举例,1.总蛋白(TP)蛋白质中的肽键+Cu2+碱性条件紫红色络合物引起在波长540560nm范围内吸光度的上升,与总蛋白含量成正比2.白蛋白(ALB)白蛋白+溴甲酚绿pH4.2白蛋白溴甲酚绿复合物引起在波长630nm范围内吸光度的上升,与白蛋白含量成正比,二、分光光度计,1光源热光源:钨灯、卤钨灯（3202500nm）气体放电光源：氢灯、氘灯（185375nm）。氘灯发光强度比氢灯强35倍，是目前紫外光区常用光源。,2.单色器单色器是一种用来把光源发出的复合光分解成单色光，并能任意改变所需波长的装置。(1)棱镜玻璃棱镜的折射率大、色散能力也大，因而分辨本领高。但它吸收紫外光，因此只适用于3503000nm的波长范围。石英棱镜对紫外光吸收少，适用于195-4000nm间分光。但由于石英棱镜折射率低于玻璃，因而色散能力差。,(2)光栅光栅是利用光的衍射、干涉原理制成的色散元件。目前，全息光栅在质量上，成本上都大大优于机械光栅。因光栅分光在紫外和可见光区均适用，且色散力强、分辨率高，故近年生产的分光光度计大都采用光栅作单色器。,3比色杯比色杯可由玻璃和石英等材料制成，玻璃适用于350nm以上光区，而石英杯则适用于紫外和可见光区。,4检测器在分光光度计中，把光信号转变成电信号输出的装置称检测器。光电池光电管光电倍增管,双波长分光光度计来自光源的光被两个单色器分别分离出波长为1和2的两束单色光。经过折波器后，两束波长不同的单色光交替地照射于同一样品杯。样品杯背后的光电倍增管交替地接收到两种波长照射吸收池后所产生的信号。此信号经电子电路转化为两个吸光度之差A。,三、酶法分析,酶法分析包括两方面的内容：借助酶来测定某一化合物的浓度，如测定体液中的葡萄糖、甘油三酯、胆固醇、尿素、尿酸、肌酐等。借助酶来测定另一种酶的活性，实际上是用酶来测定待测酶的产物，如转氨酶、肌酸激酶、淀粉酶等。,葡萄糖葡萄糖O2H2O葡萄糖氧化酶葡萄糖酸H2O2H2O2苯酚4-氨基安替比林过氧化物酶醌亚胺H2O尿素尿素H2O脲酶2NH4+CO2NH4+-酮戊二酸NADH谷氨酸脱氢酶谷氨酸NAD+H2O,肌酸激酶（CK）磷酸肌酸ADPCK肌酸ATP葡萄糖ATPHK葡萄糖-6-磷酸ADP葡萄糖-6-磷酸NADPG6PDH6-磷酸葡萄糖酸NADPHH+丙氨酸氨基转移酶（ALT）丙氨酸-酮戊二酸ALT丙酮酸谷氨酸丙酮酸NADHH+LDH乳酸NAD+H2O,酶催化特点,高度的特异性高催化效率作用条件温和,酶的活性部位,底物结合部位催化部位,酶的辅助因子,金属离子辅基和辅酶NAD，NADP,酶的分类,1.氧化还原酶2.转移酶3.水解酶4.裂合酶5.异构酶6.合成酶,酶的系统命名,应将酶的一种或两种底物以及催化反应的性质明确标明。乳酸脱氢酶L-乳酸：NAD+氧化还原酶肌酸激酶ATP：肌酸磷酸转移酶,酶的活性单位,一国际单位为在一分钟内催化转变1个微摩尔的反应物的酶量.IUUU/L1Katal为每秒钟转化1mole底物的酶量1国际单位=16.67nKatal1Katal=6107国际单位,酶活性测定,影响酶活性测定：底物、激活剂、抑制剂、缓冲液、pH、温度、酶浓度。在最适条件下以求达到最大的反应速度。但由于底物的溶解度低，或售价太高，或需连锁的酶反应，则必须对测定条件作修正。,酶活性测定的最适条件,合适的底物、辅因子、活化剂、变构剂的种类和浓度指示酶和辅助酶的种类和浓度反应混合液的最适pH，缓冲液种类和浓度去除各种抑制剂,酶促反应的两个阶段,反应级数0级1级P1.可逆反应2.产物抑制3.酶变性失活v=dP/dt4.底物不饱和S时间t,酶反应进程和酶浓度曲线,酶量E401.E越大，线性反产应期越短物2.E相同，S越小，P20线性反应期越短10505101520时间(min),酶反应时间曲线,时间(min)5(t0)反应时间越短，10(t1)线性范围越大15(t2)20(t3)010203040酶量E,米氏方程,E+S,ES,E+P,k,k,k,k,+1,+2,-2,-1,v,V,2,SKm,米氏曲线,S,V,Vmax,Km,Vmax2,Km,Km,米氏常数,米-孟氏公式：vVmS/(KmS)当SKm时，则vVm，即反应速度是一个常数，为零级反应。如SKm时，混合级反应。,米氏常数的意义,如v0.5Vm，则KmS，Km值等于酶促反应的初速度为最大速度的一半时所需的底物浓度。Km等于ES的解离常数；而Km的倒数可代表酶和底物的亲和力。Km是酶的特征性常数，当pH、温度和离子强度恒定时，Km只和酶及底物的性质有关，而与酶浓度无关。纯度不同的同一种酶，如杂质中没有可使底物发生旁反应的其它酶或酶的激活剂和抑制剂，则Km的变化不大。,米氏常数的应用,（1）如已知酶的Km，可计算某一底物浓度时的v/Vm。（2）如要求v占Vm一定的百分比，也可算出所需底物浓度为其Km的多少倍。（3）利用工具酶来测定某一底物的浓度时，可计算工具酶的用量。,（4）测定几个同工酶对同一底物的Km，可估计是原级（Km常有差异）还是次生性同工酶（Km接近或相同）。（5）测定正逆方向底物的Km，可大体知道该酶催化哪一方向为主。（6）如已知一组酶中各酶的Km及其相应底物的浓度，有助于寻找限速步骤。,Km的求取,Lineweaver-Burk作图法1/v(Km/Vm)(1/S)1/VmEadie-Hofstee作图法vVmKm(v/S)Eisenthal和Cornish-Bowden作图法设Y轴和X轴分别为求取Vm及Km的座标，将不同S浓度点在X轴的负侧；相应的反应速度点在Y轴上，连接各线，交点在Y轴上的座标为Vm，在X轴上的座标为Km。,酶活性测定的基本知识,酶活性是通过测定酶促反应过程中单位时间内底物的减少量或产物的生成量，即测定酶促反应的速率来获得的。,（1）定时法测定酶反应开始后某一时间内（t1到t2）产物或底物浓度的总变化量来求取酶反应初速度的方法称为定时法。产2物3生1成t1t2,（2）连续监测法连续测定（每15s1min监测一次）酶反应过程中某一反应产物或底物的浓度随时间的变化来求出酶反应初速度的方法称为连续监测法，又称动力学法或速率法。这种方法的优点是可将多点的测定结果连接成线，很易找到成直线的区段，来计算酶活性。此法较为准确。分为直接连续监测法和间接连续监测法。法.,连续监测法的测定时间,吸光度A3A2A1t1t2t3t4时间,（3）平衡法通过测定酶反应开始至反应达到平衡时产物或底物浓度总变化量来求出酶活性的方法称为平衡法。用平衡法测定时，因产物的增加或底物的减少与反应时间不成线性，故不能把P或S的总变化量除以t来代表每分钟产物或底物的变化。另外，平衡法也会受到产物抑制、可逆反应等因素的影响，由于反应时间较定时法长，故这种影响会更大，测定结果也较连续监测法低。对于有些零级反应期很短的酶促反应，用连续监测法和定时法很难测出其初速度，也只得采用平衡法测定。,定时法与连续法比较,定时法条件无限制试剂需量少，经济采用放射性试剂时，灵敏度高结果不能立刻揭晓人工操作多，费时毋需偶联酶产物会生抑制作用,连续法因偶联酶使条件受限制需量较大与放射性试剂来比，灵敏度低结果立刻揭晓人工操作少偶联酶的费用很大偶联作用能消耗产物,（一）工具酶及酶偶联反应,通过酶偶联反应间接地测出第一个酶促反应中待测物的浓度或待测酶的活性。那些作为试剂用于测定化合物浓度或酶活性的酶称为工具酶。,AB酶1CDC（或D）E酶2FGF（或G）H酶3IJ酶1：待测酶酶2：辅助酶酶3：指示酶E、H：辅助底物,在利用工具酶的反应中，唯一的限速因子应该是待测化合物或待测酶。对工具酶试剂中的杂质（杂酶、抑制剂等）的含量也有一定的限制，以减少或避免干扰测定的副反应。,如果工具酶制剂中污染了待测酶会对测定结果产生严重影响。如天冬氨酸转氨酶（AST）测定的工具酶是苹果酸脱氢酶（MDH），如污染0.03%的AST，则当AST活性为7U/L时，测定误差为6%。而测定丙氨酸转氨酶（ALT）的工具酶是乳酸脱氢酶（LDH），如污染0.03%的ALT，则当ALT活性为5U/L时测定误差也是6%。,（二）常用监测物质的特性,1NADH或NADPH：乳酸脱氢酶（LDH）NAD+或NADP+苹果酸脱氢酶（MDH）NAD+或NADP+谷氨酸脱氢酶（GLDH）NAD+或NADP+6-磷酸葡萄糖脱氢酶（G6PD）动物G6PDNADP+微生物G6PDNAD+,NADH或NADPH在340nm有特征性光吸收，而它们的氧化型NAD+或NADP+则没有这个吸收峰，340nm波长处的吸光度与NAD（P）H的浓度成正比。另外NAD（P）H有强烈的荧光，其激发波长为340nm，发射波长为460nm。,max,：340nm,肌酸激酶（CK）磷酸肌酸ADPCK肌酸ATP葡萄糖ATPHK葡萄糖-6-磷酸ADP葡萄糖-6-磷酸NADPG6PDH6-磷酸葡萄糖酸NADPHH+丙氨酸氨基转移酶（ALT）丙氨酸-酮戊二酸ALT丙酮酸谷氨酸丙酮酸NADHH+LDH乳酸NAD+H2O,2H2O2指示反应,葡萄糖氧化酶、尿酸酶、甘油氧化酶、胆固醇氧化酶：用于葡萄糖、尿酸、甘油、胆固醇的测定，可使相应底物被O2氧化成H2O2，H2O2可通过下列指示反应来检测。,使单一的色素原显色。无色色素原过氧化物酶（POD）存在下被H2O2氧化后可生成有色的色素。使成对的色素原显色。必须要两个色素原共同存在，再在指示酶POD的催化下生成色素。发光反应。H2O2也可用化学发光反应来监测，它是凭借某些荧光前身物在氧化后，处于激发状态的分子可发射光子，光子量和H2O2的浓度成正比。,葡萄糖葡萄糖O2H2O葡萄糖氧化酶葡萄糖酸H2O2H2O2苯酚4-氨基安替比林过氧化物酶醌亚胺H2O甘油三酯甘油三酯H2O脂蛋白脂酶甘油脂肪酸甘油ATP甘油激酶-磷酸甘油ADP-磷酸甘油O2甘油磷酸氧化酶磷酸二羟丙酮H2O2H2O2+4-氨基安替比林+ESPAS过氧化物酶醌亚胺H2OESPAS:N-乙基-N-(3-磺丙基)-间-茴香胺,3硝基苯衍生物,芳香酯酶、磷酸酯酶和硫酸酯酶：对-硝基酚和有机酸或无机酸形成的酯类糖苷酶：对硝基酚和糖苷衍生物-谷氨酰转肽酶、芳香酰胺酶和胰蛋白酶：对-硝基苯胺的氨基酰衍生物故硝基苯酚或硝基苯胺作为底物的结合型化合物均无色，而一旦水解或游离型产物在pH大于8的碱性条件下能生成黄色的醌类离子型化合物，在400nm410nm有光吸收峰，其吸光度与浓度成正比。,max,：405nm,碱性磷酸酶（ALP）磷酸对硝基苯H2OALP磷酸盐对硝基苯酚-谷氨酰转移酶（-GT）-谷氨酰对硝基苯胺双甘肽-GT谷氨酰基双甘肽对硝基苯胺,（三）酶法分析的类型,用工具酶测定体液中代谢物的浓度，一般可用两种不同的测定方法。,1代谢物浓度的酶法分析,（1）终点法将待测底物与工具酶保温一定时间后，全部转变成可监测的化合物，然后测定后者的总量来计算待测物的总量或浓度。尿素H2O尿素酶CO22NH3乙醇NAD+醇脱氢酶乙醛NADHH+反应常呈一级反应。使待测底物完全转变所需的时间取决于加入的工具酶量。,（2）动力学法待测物不必完全转变成可监测的化合物，而是利用工具酶反应速率来定量其浓度：一是利用零级反应，如待测物是某个工具酶的激活剂或抑制剂，其浓度可决定该工具酶的反应速度，可采用此方法。因测定时该工具酶本身及其底物都是足量的，故反应为零级反应。,例：测定血清中肝素AT肝素AT（AT为肝素与AT复合物）AT凝血酶凝血酶-AT（无活性）残余凝血酶甲苯磺酰-甘-脯-精-4NA凝血酶甲苯磺酰-甘-脯-精4-硝基苯胺,二是利用一级反应，本法的基本要求是作为某一工具酶底物的待测物的浓度S必须远小于该工具酶的Km。此时反应速度基本上与S成正比，呈一级反应。动力学法较终点法具有简便、省时、干扰少、可测定低浓度物质、不需样品对照以及易于自动化等优点，成为自动化分析的主要方法。但此法必须同时测定标准样品的反应速度，来推算未知样品中待测物的浓度。,2酶活性测定的酶法分析这类酶学分析法是用工具酶来测定待测酶的产物以求取待测酶的活性，适合于待测酶产物不能直接监测的情况。也可有终点法和动力学法两种。,（1）终点法将底物与待测酶反应一定时间后，终止反应，再用指示酶测定该时间内产物的生成量即可算出酶活性。,（2）偶联反应的基本动力学,SExP1EiP2应先将样品与工具酶预保温，使样品中的内源性干扰物充分催化消耗，然后加入底物S起动反应。起动后，因P从零开始升高，故工具酶反应速度也较低，不能代表待测酶反应速度，这一时期称为延滞期。随着反应进行，进入恒态期，只要工具酶用量足够，就能正确地反映酶的活性.,A延迟期恒态期非恒态期1.51.0SExP1EiP20.50306090120150180秒（以NADH减少为指示反应）如Ei用量过少，Ex的速度Vx大于Ei的速度，即P1生成的速度大于P1消失的速度，可导致P1的逐渐堆积，不能成为恒态或其延滞期极长。但如Ei用量足够，Vi等于或大于Vx，则P1一旦生成可较快或很快转变成P2，P1产生与消失速度一致而成为恒态。,（四）酶活性浓度的计算,Vt106U/L（A/min）VsLA吸光度变化Vt为反应系统总体积Vs为样品体积为被测物的摩尔吸光系数(mol-1cm-1)L为光径106是将mol转化成mol。,常数K值的意义和设置,Vt106U/L（A/min）VsL（A/min）KVt106KVsL,常数K值的检验,：pH；温度；单色光；仪器信号接收V：仪器加样系统对一些性质稳定的物质如对硝基酚、对硝基苯胺，可以用高纯试剂配成标准品，将它们作为标本进行酶的测定，根据其浓度和吸光度变化可计算出实际K值。对NAD(P)H，可使用测葡萄糖试剂盒，对已知浓度的葡萄糖标准品进行终点法测定，此法产生与葡萄糖相等摩尔数的NAD(P)H，故不难从吸光度变化求出K值。,利用标准管的方法较简单，但标准管的浓度必须在该比色法或紫外分光光度法测定的浓度线性范围内。标准曲线法可得浓度和吸光度的线性范围，消除浓度过高偏离线性的影响，但标准曲线的制备时间与测定样品的时间不同，容易产生试剂批号、配制、实验温度、仪器工作状态等因素造成的误差。,单试剂、双试剂、液体试剂,1.单试剂的优缺点优点：操作简便适用于各类生化分析仪缺点：配方复杂（稳定剂、掩蔽剂），稳定性差，不能完全避免内外源物质干扰。2.双试剂的特点（1）可较彻底排除样品空白和内外源干扰物（2）更加符合酶偶联反应的特性和过程（3）试剂配方简单（4）试剂稳定，便于储存，运输和使用（5）可用抑制法直接测定某些同工酶,3.液体试剂的优点（1）不需手工调制，省工省时（2）试剂批间差小，重复性好（3）杜绝干粉试剂重溶时因水质差引起试剂变质（4）有利于急诊标本（5）按需取量，避免浪费,自动生化分析仪主要参数,测定方法学类型的选择:终点法,速率法,固定时间法温度波长样品与试剂量延迟时间测定时间浓度校正因子,四、免疫浊度分析法,抗体（Ab）与可溶性抗原（Ag）反应，形成一定结构的免疫复合物，成为悬浮于反应溶液中的微粒。在沉淀反应中形成的复合物微粒具有特殊的光学性质，可用仪器检测，提高了方法的速度、灵敏度和易操作性。,抗原-抗体沉淀反应的特征,1.抗体过剩区：随着抗原浓度增加，IC也相应增加，浊度增加。2.等价点：抗原抗体相当时，所有抗体与抗原形成IC，浊度最大，达到等价点。3.抗原过剩区：抗原过量存在，不但不会形成更多的IC，反而会引起原先的IC溶解，浊度下降，产生虚假的低浓度结果。,1透射比浊测定法是测定入射光强度由于溶液中粒子的散射而降低的程度，它并不直接测定散射的光强。这一点与分光光度测定法极为类似。用这种方法时，多用聚乙二醇（PEG）作为反应增强剂。这种非离子型聚合物可以降低抗原抗体复合物的溶解度。2散射比浊测定法它是直接测定溶液中微粒所散射的光强。散射比浊法也已经用于自动分析仪器中。,3免疫浊度测定中应注意的问题（1）伪浊度的影响。非特异的交叉反应增浊剂浓度反应时间样品本身的浊度试剂的污染和变质器材不够清洁,(2)钩状效应（hookeffect）的影响。当Ag和Ab浓度比例不当时，不能有效地形成免疫复合物，产生弱阳性甚至假阴性结果。(3)严格的室内质控是极必要的。(4)标准曲线的制作.,五、方法学评价,（一）准确度试验准确度是指测定值与“真值”的符合程度。是评价一项实验方法是否可取的重要指标。1标准物鉴定为了确定和评价方法的准确性，常用基准标准液或参考血清为样本进行检测，所得结果经统计学处理，以衡量方法的准确性。,2回收试验回收率的计算是（回收值/加入值）100，这里的回收值是指标本中加入标准液后的测定值减去标本原来的测定值。回收率达到1005者为准确性符合要求的方法。,回收试验应注意：样品的选用样品最好应用新鲜混合血清。标准物的加入应先配制成适当浓度的标准物溶液，再加入到基础样品中。所加标准溶液量越少越好。标准物的加入浓度最好同时设计几个加入不同浓度标准液的试验样品。加入标准液后的试验样品的总浓度不能超过本方法的线性范围。操作准确标准液的加入量必须准确无误，应经多次试验。,（二）精密度试验,目前常以重复性试验来衡量一个方法的精密度。一般来说，标准差、变异系数（CVs/x100）小的实验方法精密。1批内精密度试验取一份样品，用欲测项目实验方法进行操作，反复测定20次以上，计算每一次的测定结果，然后计算x、s、CV。2批间精密度试验这种试验也是同一份标本进行重复测定，至少为20次。但是重复测定不是在一天内完成，而是每天随患者标本一起测定，再计算x、s、CV。,（三）灵敏度试验,灵敏度是单位浓度变化所引起的指示物理量的变化。在定量分析中是指被检测物单位浓度的变化所引起的物理量的变化。所选用的方法，应进行线性试验，选用线性范围宽度适宜的方法。线性检验所得结果，可用回归方程（YabX）处理，回归系数（b）为灵敏度大小的指标，回归系数大，灵敏度高，反之亦然。不同方法也可用回归系数进行比较，回归系数大的灵敏度高。,（四）线性试验,线性试验是衡量一个方法的检测范围的一种实验。通过线性试验，可以了解该方法的最高检测值和最低检测值。超出上下限值的结果是不可靠的，为使结果可靠，遇到这种情况应加大样品用量或稀释样品后再次检测。线性试验的