《FCM样本制作》PPT课件.ppt

流式细胞术的样品制备,汪洪涛C座402bb_,2020/5/29,免疫学实验中心,2,流式细胞仪,BD公司FACSCalibur,2020/5/29,免疫学实验中心,3,凡是能被荧光素标记的且这种荧光素能被流式细胞仪所配置的激光光源激发的细胞或颗粒，都可用流式细胞仪检测。在生物检测技术中流式细胞仪是不可多得的一机多用的仪器。,FCM的应用广泛：,2020/5/29,免疫学实验中心,4,2020/5/29,免疫学实验中心,5,流式参与研究的学科种类,2020/5/29,免疫学实验中心,6,应用流式发表的论文统计,2020/5/29,免疫学实验中心,7,怎样利用流式细胞仪进行科学研究呢？,？,2020/5/29,免疫学实验中心,8,流式细胞仪的特点,单个细胞分析同时多参数分析速度快：10000个细胞/秒统计学意义：提供细胞群体的均值和分布情况分选感兴趣的细胞,2020/5/29,免疫学实验中心,9,FCM的液流系统（如何形成单个细胞流）,样本管,鞘液管,2020/5/29,免疫学实验中心,10,2mainsortsofparametersaremeasuredLightScatterFluorescence,流式的工作原理,2020/5/29,免疫学实验中心,11,LightScatter,流式细胞仪的散射光信号,2020/5/29,免疫学实验中心,12,LightScatter,2020/5/29,免疫学实验中心,13,流式细胞仪的散射光信号,FSC:表示细胞大小SSC:表示细胞内颗粒的复杂程度,2020/5/29,免疫学实验中心,14,光源,FSC测大小,SSC测粒度,SSCcell粒度FSCcell体积,散射光信号,流式细胞仪信号获取与分析,2020/5/29,免疫学实验中心,15,外周全血细胞散射光双参数点图（红细胞溶解后）,2020/5/29,免疫学实验中心,16,荧光信号,荧光素吸收激光能量荧光素将吸收能量释放，转换为振动能和热能释放较入射光波长更长的光量子荧光素与特异抗体结合荧光抗体与细胞抗原结合越多，产生的荧光信号越强,Fluorescence,2020/5/29,免疫学实验中心,17,Fluorescence,1.自身荧光,即不经荧光染色细胞经光照射后所发出的荧光,A.细胞成分中能够产生的自发荧光的分子(例核黄素、细胞色素等)的含量越高，自发荧光越强；B.培养细胞中死细胞/活细胞比例越高，自发荧光越强；,2020/5/29,免疫学实验中心,18,2.特异性荧光,由细胞经染色结合上的荧光染料受光照而发出的荧光,2020/5/29,免疫学实验中心,19,荧光染料的特性,激发波长(EXCITING)发射波长(EMISSION),2020/5/29,免疫学实验中心,20,荧光素的选择,1.荧光染料有多种,他们分子结构不同,激发光谱和发射光谱也各异（荧光素发光原理略）2.选择荧光染料时必须依据流式细胞仪所配备的激光光源的发射光波长(如氩离子气体激光管,它的发射光波488nm,氦氖离子气体激光管发射光波长633nm）,激发光波长（nm）发射光峰值（nm）FITC488525（绿）PE488575（橙红）PI488630（橙红）ECD488610（红）CY5488675（深红）PreCP488675（深红）,2020/5/29,免疫学实验中心,21,3.抗原丰富度决定荧光素的选择高密度表达的抗原我们可以应用任何荧光素标记的抗体来检测，低密度表达的抗原就需要我们应用高信噪比高的荧光素例如：细胞表面的CD3细胞产生的IFN-可以用任何荧光素标记的抗体而IL-4则最好用APC等高信噪比的荧光素标记的抗体,2020/5/29,免疫学实验中心,22,DirectStaining,CD4+cellplusmonoclonalantibodytoCD4conjugatedwithFITC,2020/5/29,免疫学实验中心,23,IndirectStaining,CD4+cellplusunconjugatedantibodytoCD4plusFITCconjugatedgoat-anti-mouseIgGassecondaryantibody.,2020/5/29,免疫学实验中心,24,抗体的选择,首选直接标记抗体荧光分子PE最强，适用于弱表达抗原FITC最便宜，适用于强表达抗原间接标记：一般不提倡用,2020/5/29,免疫学实验中心,25,流式细胞仪测定的是单个粒子的荧光,要求样本必须是单细胞的悬液,如何制作样本？,单层培养细胞分散成单个细胞,实体组织分散成单个细胞,染色等操作,2020/5/29,免疫学实验中心,26,实验标本的处理,单细胞悬液的制备：胰酶消化抗体或标记分子的染色：抗原抗体反应非特异结合的去除：洗涤和封闭封闭：血清和同型抗体,2020/5/29,免疫学实验中心,27,一、单层培养细胞分散成单个细胞,操作步骤,适用细胞：贴壁生长，如3T3Hela,1.将单层培养细胞（对数生长期）旧培养液倒掉,2.加少量0.25%胰酶，过一遍瓶后倒掉,3.加入1-2ml0.25%胰酶，在倒置显微镜下观察,2020/5/29,免疫学实验中心,28,刚加入胰酶，细胞仍呈致密单层,细胞开始皱缩但不明显，仍维持细胞正常形态,2020/5/29,免疫学实验中心,29,细胞基本皱缩变圆，此时细胞吹打可下,细胞完全皱缩变圆，此时应弃去胰酶，加入培养基后轻摇可将细胞从细胞瓶壁上洗下,2020/5/29,免疫学实验中心,30,4.加入染色缓冲液（PBS+1%BSA），反复吹打，使之成为单细胞悬液,5.移入离心管内，离心1000-1500rpm5min,6.弃上清，重悬管内细胞后，加染色缓冲液，洗涤细胞,2020/5/29,免疫学实验中心,31,二、实体组织分散成单个细胞,机械法,剪刀剪碎、手术刀切碎、匀浆器匀浆、尼龙网或者不锈钢网,酶处理法,胰酶、胶原酶溶菌酶木瓜蛋白酶等等,单纯采用机械或者酶处理法效果都不太理想，往往是将两者结合,2020/5/29,免疫学实验中心,32,实体瘤分散试验实例：1.从动物身上取瘤后，立即投入4度含有10NCS的培养介质中2.取0.20.5g瘤组织并切碎3.切碎瘤组织放入混合酶液中（DNA酶胶原酶链霉蛋白酶）4.37度消化3060min5.过滤，离心，弃上清6.用含10NCS的培养介质洗涤细胞2次7.重悬细胞,300目或者400目（37um）滤网过滤,目x孔径15400,2020/5/29,免疫学实验中心,33,单细胞悬液的处理,根据实验目的的不同，处理过程亦不相同,细胞表面标记分子检测,胞内细胞因子分析,细胞周期分析,细胞早期凋亡分析,2020/5/29,免疫学实验中心,34,细胞表面标记分子检测淋巴细胞亚群分析,抗凝外周静脉血1030ul,染色,溶血剂溶血,染色缓冲液洗涤,1PFA固定15分钟,上流式检测,2020/5/29,免疫学实验中心,35,淋巴细胞亚群报告模式,CD4+,CD8+,2020/5/29,免疫学实验中心,36,胞内细胞因子分析PBMC产生IFN-测定,取抗凝外周静脉血1ml,PMA+Ionomysin374h,Monosin372h,收集细胞，洗涤，(表染),溶血、洗涤、固定,破膜、胞内细胞因子染色,洗涤，加1%PFA，检测,2020/5/29,免疫学实验中心,37,2020/5/29,免疫学实验中心,38,IntracellularCytokine-Protocol,2020/5/29,免疫学实验中心,39,细胞周期分析-PI染色测细胞周期,上机,检测、分析,获取单细胞悬液，洗涤,70%冷乙醇42h,RNaseA悬浮消化30min,PI染液作用430min,筛网过滤,上机检测,2020/5/29,免疫学实验中心,40,2020/5/29,免疫学实验中心,41,细胞周期,G1,M,G2,S,Quiescentcells,G0,2020/5/29,免疫学实验中心,42,AtypicalDNAHistogram,G0-G1,S,G2-M,FluorescenceIntensity,#ofEvents,2020/5/29,免疫学实验中心,43,2020/5/29,免疫学实验中心,44,细胞早期凋亡分析