细胞培养完整手册

细胞培养手册常用设备准备室设备：单蒸馏水蒸馏器，双蒸馏水蒸馏器，酸缸，烤箱，高压锅，储藏箱(放置未消毒的)，储藏箱(放置消毒的)，包装台。 供水室的设备：扭转天平和电子天平(称量药品)、PH计(测定培养用液的PH值)、磁力搅拌器(配置溶液室搅拌溶液)。培养室设备：液氮罐、储藏箱(装垃圾)、荧光灯和紫外线灯、空气净化器系统、低温冰箱(-80)、空调、二氧化碳罐、侧台(写实验记录)。无菌间必须放置的设备：离心机(收集细胞)、超净台、倒立显微镜、CO2孵化器(孵化培养物)、水浴锅、三氧消毒杀菌机、4冰箱(放置serum和培养用液)。无菌操作的基本技术无菌室灭菌：1 .定期清洁无菌室：每周一次，用自来水拖地板，擦拭桌子，清洁桌子，然后用3通过或新闻消除，用0.5 %过氧乙酸擦拭。2.CO2孵化器(孵化器)灭菌：先用3新洁尔擦拭，然后用75 %酒精擦拭，或者擦拭0.5 %过氧乙酸，然后用紫外线灯照明。3 .实验前灭菌：将紫外线灯、三氧杀菌机、空气净化机系统各打开20-30分钟。4 .实验后的灭菌：用75 %的酒精(3新洁尔灭)擦拭超清台、边台、倒置显微镜的载物台。5 .定期检查以下项目：钢瓶的CO2压力； CO2培育箱的CO2浓度、温度及水盘是否有污染(水盘的水为无菌水，每周更换)。 无菌操作台内的airflow压力定期更换紫外线灯和HEPA过滤膜、预滤器(300小时/预滤器、3000小时/HEPA )。6 .水槽可以添加消毒剂(Zephrin 1:750 )，定期更换水槽的水。实验人员无菌准备：1 .用肥皂洗手。2 .穿隔离服，戴隔离帽，戴口罩，放拖鞋用75 %酒精棉球擦拭双手。无菌操作演示：1 .带入超洁净工作台内的酒精、PBS、培养基、胰蛋白酶的瓶子用75 %酒精擦拭瓶子的外表面2 .靠近酒精灯的火焰操作。3 .在使用器皿之前，必须先通过火灭菌持续使用的容器(瓶盖、吸管等)放在高处，使用过度。5 .各种操作要靠近酒精灯，动作轻，准确，不要乱碰。 请不要让吸管接触废液罐。6 .吸入两种以上使用液体时，要注意更换吸管，防止交叉污染。仪器的清洗和消毒清洗玻璃器具：一、清洗新玻璃器具：1 .刷洗自来水，去除灰尘。2 .干燥、泡沫盐酸：用烤箱干燥，再用5 %稀盐酸浸泡12小时，去除污垢、铅、砷等。刷牙，干燥： 12小时后马上用自来水冲洗，用洗涤剂冲洗，自来水干净后用烤箱晾干。4 .泡酸、洗涤：用洗涤液(重铬酸钾120g :浓硫酸200ml :蒸馏水1000ml )浸泡12小时后，从酸缸中取出容器用自来水洗涤15次，最后用蒸馏水洗涤35次，用双蒸馏水洗涤3次。5 .干燥、包装：洗净后干燥，用牛皮纸(油纸)包装。6 .高压消毒：将包装的容器放入高压锅盖上，打开开关和安全阀，蒸汽直线上升时，关闭安全阀，指针指向15磅时，维持20-30分钟。7 .高压消毒后干燥二、清洗旧玻璃器具：1 .刷洗、干燥：使用过的玻璃器具直接浸泡在洗涤液或洗涤剂液中，浸泡在洗涤液(洗涤剂)中的器具用清水洗净后干燥。2 .泡酸、清洗：干燥后浸泡清洗液(酸液)，12小时后从酸缸中取出容器，立即用自来水清洗(避免蛋白质干燥附着在玻璃上清洗困难)，用蒸馏水清洗3次。3、干燥、包装：洗干净器皿干燥后，用牛皮纸(油光纸)等包装，防止消毒贮藏和灰尘再污染。4 .高压消毒：包装的容器进入高压锅，盖上盖子，打开开关和安全阀，随着温度的上升从安全阀排出蒸汽，蒸汽直线排出35分钟后，关闭安全阀，气压计指数上升，指针指向15磅时，调节电气开关维持20-30分钟即可。 (玻璃培养瓶在消毒前可轻轻复盖橡胶帽)5 .干燥预备：高压消毒后，器具会被蒸汽弄湿，所以放入烤箱预备干燥。 清洗金属器具：金属器具不得加酸。 清洗时用洗涤剂洗净，用自来水洗净后用75 %酒精擦拭，用自来水洗净，用蒸馏水洗净后晾干或在空气中晾干。 放入铝盒中，用高压锅内的高压15磅(30分钟)消毒，干燥。橡胶和塑料：橡胶和产品的常规处理方法是先用洗涤剂洗涤，再用自来水和蒸馏水洗涤，再用烘箱烘干，根据质量进行如下处理步骤1 .线点过滤器盖不得浸泡酸液。 用NaOH浸泡6-12小时，或煮沸20分钟，包装前安装2片过滤器，安装过滤器时要注意光面向上(凹上)，然后稍微松开螺旋，放入铝盒中在高压锅中消毒15磅30分钟后再干燥。 注意在超清洁工作台内取出使用时，请立即拧紧螺旋。2 .橡胶塞干燥后，用2 %氢氧化钠溶液煮沸30分钟(用过的橡胶塞用沸水处理30分钟)，用自来水洗净，干燥。 然后，将盐酸液浸泡30分钟，用自来水、蒸馏水、三蒸水洗净，干燥。 最后放入铝壳高压消毒，干燥备用。3 .橡胶帽、离心管帽干燥后，2 %氢氧化钠溶液只浸泡6至12小时(不忘记时间不长)，自来水洗净、干燥。 然后，将盐酸液浸泡30分钟，用自来水、蒸馏水、三蒸水洗净，干燥。 最后放入铝壳高压消毒，干燥备用。4 .糊头用75 %酒精浸泡5分钟，然后照射紫外光使用即可。5 .塑料培养瓶、培养板、冷冻保存管6 .其他消毒方法：有些既不能干燥消毒也不能蒸汽消毒，可以用70 %的酒精浸泡消毒。 塑料培养皿打开盖子，放在超洁净的桌子上，直接暴露在紫外线下消毒。 也可以用氧化乙烯消毒塑料制品，消毒后残留的氧化乙烯需要在23周内洗净。 20000用rad的r线消毒塑料产品最有效。 为了不让清洗器材消毒和最后的消毒混淆，用纸包装后，用墨做上记号。 其方法是，在洒了水的笔或毛笔上涂上墨水，在包装纸上做上记号，平时这种墨水没有痕迹，一旦变成高温，就可以判断是否会出现字，消毒。 写入油墨的制备：氯化钻(CoC126H2o) 2g、30%盐酸10m 1、蒸馏水88m1。注意事项：1 .严格执行高压锅操作规程：高压消毒时，应首先检查锅内是否有蒸馏水，以免高压时干燥。 水过多会使空气平稳受阻，降低高压消毒效果。 检查安全阀是否畅通，避免高压时爆炸。2 .安装滤镜时，请注意光面朝上。 注意过滤器的光滑面是正面，朝上。 不那样的话，就起不到过滤器的作用。3 .注意人体防护和器具完全浸泡： a .加酸时要戴耐酸手套，以免酸液伤害人体。 b .从酸缸中取出容器时，防止酸液洒到地面上腐蚀地面。 c .器皿浸在酸液中必须完整。 气泡不能留下来。细胞培养用液的制备与消毒器材和试剂：干粉型培养基，胰蛋白酶，青霉素，链霉素.纯水系统，电子天平，PH计，磁力搅拌器。具体步骤：一、水的制备：细胞培养用水必须非常纯净，不含离子和其他杂质。 我们需要新鲜的二水、三水和纯水。二、PBS的制备和消毒(也可用于其他BSS，如Hanks、D-Hanks液的制备)。1 .溶解定容：将药品(NaCl 8.0g、KCl 0.2g、Na2HPO4H2O 1.56g、KH2PO40. 2g )放入装有双蒸馏水的烧杯中，搅拌玻璃棒，充分溶解后，将溶液放入容量瓶中直至1000ml，制成均匀调制的PBS溶液。2 .放入溶液瓶消毒：将PBS放入溶液瓶(大吊灯瓶)，盖上橡皮帽，插针放入高压锅消毒8磅。 注意高压消毒后，用灭菌蒸馏水补充蒸发的水分。三、胰蛋白酶溶液的制备和消毒：胰蛋白酶的作用是水解细胞间的蛋白质使细胞离散。 不同组织和细胞对胰酶的反应不同。 胰酶分散细胞的活性与浓度、温度和作用时间有关，pH为8.0，温度为37时胰酶溶液的作用力最强。 使用胰酶时，要掌握浓度、温度、时间，以免过度消化损伤细胞。 为了降低胰酶的活性，Ca2、Mg2和血清、蛋白质图在制备胰酶溶液时选择不含Ca2、Mg2的BSS，如D-Hanks液。 停止消化时，可以停止血清培养液或含胰蛋白酶抑制剂的胰酶对细胞的作用。1 .胰蛋白酶的称量：按胰蛋白酶液的浓度计为0.25 %，用电子天平将粉剂少量溶解于烧杯中的双蒸散水(需要用双蒸散水将PH调整到7.2左右)或者准确地称量为PBS (D-hanks )液。 混合，在4下过夜。2 .用注射过滤器吸引消毒：调制的胰酶溶液应在超纯台内用注射过滤器(0.22微米微孔过滤器)吸引除菌。 然后分成小瓶在-20下保存使用。四、抗生素溶液的制备1 .使用的纯水(双蒸发水)需要在15磅的高压20分钟内灭菌。2 .所有具体操作均在超清洁工作台内进行。 青霉素为80万单位/瓶，注射器加入4ml灭菌双蒸水。 链霉素为100万单位/瓶，加入5ml灭菌的双蒸散水，每毫升20万单位。3 .使用时溶于培养液中，青霉素浓度最终为100单位/ml。 1单位=1微克？4 .细胞库的细胞培养基不加抗生素5 .培养从ATC导入的细胞株，培养基中不添加抗生素。6 .培养从其他实验室引入的细胞株，制备token freeze前必须添加抗生素。 token freeze通过污染测试后大量培养，不添加抗生素。7 .在输送活细胞时，在flask整体充满培养液时，必须添加抗生素。 (penicillin 100 units/ml )streptomycin 100 ug/ml )8 .测定8.mycoplasma时，不要在培养基中添加gentamicin。 因为gentamicin抑制了mycoplasma的增长。9 .消除细菌污染的抗生素混配方： penicillin 250 units/ml，streptomycin 250 ug/mlneomycin 250 ug/ml，bacitracin 2.5 units/ml注意混合使用后的药物毒性会增加。10 .抗生素的使用种类和浓度：工作浓度.保存温度.杀菌penicillin e 100 units/ml-20g () bacteriastreptomcin 100u g/ml-20g () andg (-) bacteriachlor tetracycline 50 ug/ml-20g () andg (-) bacteriagentamicin 50 ug/ml-20g () andg (-) bacteria，mycoplasmaamphotericinb2.5ug/ml-20yeast和modsnystatin50ug/ml-20yeast和moldsfungizone2.5ug/ml-20yeast和mods五、RPMI1640的制备和消毒：1 .溶解、PH调整、定容：将培养基粉剂加入培养液体积的2/3的双蒸水中，用双蒸水清洗包装袋23次(将冲洗液一起放入培养基中)，充分搅拌直至粉剂完全溶解，按照包装说明添加药品。 然后，在培养基中加入用注射器调制的青霉素液各0.5ml，青霉素的浓度最终各达到100单位/ml。 其次，以1当量的盐酸和NaOH将PH调整到7.2左右。 最后确定容量至1000ml，均匀摆动。2 .安装蔡式过滤器：安装时，首先安装支架，按规定放入过滤器，用螺钉连接不锈钢过滤器和支架。 把腿摘下来用布包起来消毒。3 .吸滤：制备的培养液通常用过滤器过滤除菌。 通常用蔡式过滤器过滤超清洁工作台内部。4 .分注：将过滤后的培养液放入小瓶中放入4的冰箱待机。5 .使用前在100ml培养液中加入谷氨酰胺溶液1 ml (4下有效2周)。六、血清：1血清灭火：细胞培养常用的是犊牛血清，新买的血清在56的水浴中灭火30分钟后，吸滤后放入培养基使用。血清必须存放在-20 -70，存放在4时，不得超过1个月。 如果不能一次用完一根，可以将4045 ml分装到无菌50 ml的离心管中，血清冻结时体积约增加10 %，因此必须确保膨胀体积的空间。 否则，容易发生污染和容器冻裂。2 .一般厂家提供的血清无菌，无需无菌过滤。 如果血清中发现很多浮游物，请将血清放入培养基一起过滤，不要直接过滤血清。3 .瓶装(500ml )血清解冻工序(阶段解冻法)将： -20或-70至4的冰箱溶解1天，在室温下完全溶解后分注。 一般50 ml无菌离心管可分注4045 ml。 溶解过程中规律摆动应均匀(注意不要产生气泡，使温度和成分均匀，减少沉淀的产生。 请勿将-20 直接解冻至37 。 因为温度变化太大，蛋白质