大蒜根尖有丝分裂观察及多倍体诱导

遗传学实验 2015年5月29日 大蒜根尖有丝分裂观察及多倍体诱导 生命科学学院 赵子杰1 实验目的 1.通过大蒜根尖的制片，初步学会植物根尖压片法的基本技术。 2.通过大蒜根尖制片，了解细胞分裂的整个过程及染色体在各个时期的变化。 3.学会并掌握染色体简易永久片的制片技术。 4.了解和掌握秋水仙素溶液诱导多倍体的一般方法。 5.了解植物多倍体的一般形态特征及多倍体的细胞学特点。 6.对比进行多倍体诱导前后的大蒜根尖，理解四倍体与二倍体的区别。 7.通过对于有丝分裂相的观察，统计大蒜染色体数目，加深对于细胞有丝分裂过程的理解。2 实验原理 1.有丝分裂 完整的有丝分裂相包括G1期（合成前期）、S期（合成期）、G2期（合成后期）和M期（分裂期），其中G1期、S期和G2期合称间期，细胞完成DNA的复制以及有丝分裂的准备，而M期又可以分为前期、中期、后期和末期，为了形态观察的方便，本实验采用后一种分法。观察有丝分裂，重点在于观察染色体的形态。在细胞分裂前期，细胞核解体，染色质凝聚显现出染色体的形态；在前中期，染色体散乱地分布于细胞的中部；在中期，纺锤体形成，染色体受到微管的牵引，着丝粒成行排列于赤道板上；在后期，染色体受到动粒微管的牵引，向细胞两级运动；在末期，染色体重新解螺旋，细胞核重新形成。细胞染色体过程示意图见图1. 图1：细胞有丝分裂过程示意图 2.大蒜的根尖 大蒜根尖的整体结构如图2，其中只有分生区的初生分生组织由于细胞始终处于持久而强烈的有丝分裂之中而作为我们的观察对象，其余部分在制片时都应当尽量剔除来保证观察效果。 图2：大蒜根尖结构示意图 3.多倍体诱导 多倍体的诱导使用秋水仙素，秋水仙素可以阻止微管蛋白的聚合，从而使有丝分裂中期纺锤体不能正常形成，但是姐妹染色单体照常想成，只是没有被拉向两级，于是染色体数目加倍。 图3：秋水仙素的化学结构式三实验材料与器材 1.实验材料及试剂：大蒜，0.02%秋水仙素，0.2%秋水仙素，甲醇，冰醋酸固定液，70%酒精，95%酒精，醋酸洋红染液，1NHCL溶液。 2.实验器材：小烧杯，小刀片，剪刀，镊子，显微镜，载玻片，盖玻片，小试管，水浴锅，吸水纸，木试管夹。4 实验步骤1.大蒜材料的处理 稍稍去除大蒜外面干枯的鳞叶和须根，架在盛水的烧杯上进行水培，再取2小塑料管，分别加入适量的0.02%秋水仙素和甲醇，冰醋酸固定液，一起带回培养。待根长到3cm左右时，在中午12点左右，如果选取的大蒜不能萌发长出根来，则可以用刀片将其木栓组织削去一部分，再进行水培。2.前处理 为了观察有丝分裂过程中染色体的数目及形态，必须要使染色体分散。因此实验材料一定要进行前处理。即在有丝分裂盛期前一小时，切下根尖于盛有0.02%秋水仙素溶液的小瓶中，在原培养的温度继续培养一段时间（4小时），处理完后，必须用自来水冲洗多次，洗去药物。3.固定 将根尖放入甲醇冰醋酸固定液中固定3到4小时，固定后用95%酒精洗净其中醋酸，然后移入70%酒精保存液。4.解离 将固定后的根尖用清水清洗几次，然后加入1NHCL中，在60度水浴下水解5到10分钟。解离过的根尖用水冲洗2到3次。5.染色 将解离后的材料放在载玻片上用小刀片将根尖的根冠和伸长区部分切除，只留下1mm左右的生长区，然后加入一滴醋酸洋红染液。染色5至10分钟。待根尖染色至暗色，加盖玻片，用解剖针尖或柄轻轻敲击盖玻片，使生长区的细胞分散开来，再在盖玻片上加吸水纸，用拇指用力压一下。6.观察 将所制的玻片标本，置于显微镜下观察，观察染色体的数目及形态。5 实验现象与结论 1.二倍体观察 现象：细胞内染色体被醋酸洋红染成红色；细胞在各个时期均有出现，其中以间期出现的细胞数目最多；中期细胞染色体明显，染色体排列与赤道板上。 图4：大蒜根尖二倍体细胞观察结果各时期细胞分裂图见图5-9： 图5：间期观察结果 图6：前期观察结果 图7：中期观察结果 图8：后期观察结果 图9：末期观察结果2. 多倍体观察 现象：细胞内染色体被醋酸洋红染成红色；细胞染色体数目明显增多，杂乱无章地排列在细胞内部，并未平均移动到细胞两级。 图10：大蒜根尖多倍体细胞观察结果3. 染色体计数实际值实际计数值相对偏差二倍体16160多倍体32306.45% 结论：秋水仙素能诱导大蒜根尖染色体数目加倍，但由于染色体推挤混杂等因素，多倍体染色体的计数存在偏差。6 实验总结 1、解离的时间要适当，大约4min，因为解离时间的长短与实验结果的好坏有非常直接的影响，时间过长，则不仅破坏分生组织之间的果胶与纤维素等物质，也使分生组织与伸长区脱离，染色效果将会降低，而过短，则又达不到分离细胞的结果。 2、在切取根尖时大约切从根尖开始算往上1.5mm左右，若切得太短，则只会看到成熟的根冠细胞，在视野中看不到分裂期细胞；若切得太长，则会看到有很多伸长区的成熟细胞，从而影响实验结果。 3、染色时间不宜过长或过短，染色过深或过浅都会影响最终的实验结果。 4、压片时用拇指从上往下垂直用力且要避免载玻片与盖玻片之间的滑动，否则会使细胞之间重叠，影响观察。 5、观察时先用低倍镜找到分裂相的位置，再换高倍镜观察。7 思考题 1.秋水仙素诱导植物染色体加倍的原理是什么？ 答：秋水仙素可以抑制纺锤丝的形成，使细胞有丝分裂中期纺锤丝断裂或纺锤体形成受抑制，有丝分裂后期，复制的染色体无法移向两级，细胞内的染色体加倍，形成多倍体。 2.实验中为什么取23cm的根尖部分制作装片？ 答：因为在23cm的根尖部位，是细胞进行有丝分裂的分生区，制成装片易于实验观察。3.为什么染色时间不能超过30min? 答：因为染色时间过长，细胞核会被染成深紫色，颜色太深不易观察到染色体的具体数目和形态。【参考文献】1黄秋婵;韦友欢;韦方立;改进观察植物细胞有丝分裂方法的探讨J;科学教育;2008年04期2卢小玉;张豪;“观察植物细胞有