实验2：分离以尿素为氮源的微生物PPT课件

.,实验2：分离以尿素为氮源的微生物,.,尿素是蛋白质降解的产物，通常用作植物的氮肥。但是植物的根几乎不吸收尿素，尿素经微生物(脲酶)分解为氨,氨溶解于水中成为铵根离子而被植物吸收。,一、基础知识,1、尿素(脲)：,大量尿素的存在会对环境造成污染，如土壤板结、肥料利用率下降、地下水污染等。,例如：,2、选择培养基：,添加或减少某种成分，以允许某种微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基。,培养基中缺乏有机碳源时可筛选出自养型微生物,只以尿素为氮源的培养基可筛选出含脲酶的微生物,.,一、基础知识,3、玻璃砂漏斗：,玻璃砂(砂芯)漏斗有6种：G1G6(砂芯含有不同规格小孔)。G6孔径最小，细菌不能滤过。,若培养基中含有不能加热灭菌的化合物，如尿素(加热会分解)等，只能用G6玻璃砂漏斗过滤来除去微生物。,玻璃砂漏斗用前也要进行高压蒸汽灭菌(121，15min)。用后需用1mol/L的HCl浸泡，并抽滤去酸，再用蒸馏水洗至洗出液呈中性，干燥后保存。,.,一、基础知识,4、移液器：,移液器是一种在一定容量范围内可随意调节的精密取液装置（俗称移液枪）。,（1）结构：,（2）使用方法：,.,移液器的使用,根据取用溶液体积选用适当的移液器,操作方法：,.,从大值调整到小值时，逆时针旋转体积调节按纽到刚好即可。从小值调整到大值时，应顺时针先调至超过设定值后再回调。,设定体积,.,安装吸头,将移液器顶端垂直插入吸头，再轻轻用力下压的同时，左右微微转动，上紧即可。切记用力不能过猛，选择与移液器匹配的吸头。,.,吸液,1、预洗吸头：吸取、排放样液23次，让吸头内壁形成一道同质液膜，确保移液工作的精度和准度。,一般液体，正向吸液(将按钮按到第一档释放吸液)粘稠液体和易挥发液体，反相吸液(将按钮直接按到第二档吸液),2、垂直吸液、慢吸慢放：吸头垂直浸入液面2-4mm。尽量避免吸头浸入液面过深，以免液压对吸液的精确度造成影响。吸液速度切记不能过快，以免导致液体吸入移液器内部。,将移液枪提离液面需停约13秒，观察是否有液滴缓慢的流出。若有流出，说明有漏气现象。,.,放液,吸头紧贴容器壁放液。,按钮要待液体完全打出后再放松。,正向：先将按钮按至第一档，略作停顿以后，再按至第二档，这样做可以确保吸液头内无残留液体。反向：轻按按钮至第一档，排出液体。继续按住按钮，将留在吸头中的多余液体返回原来容器或随吸头丢弃。,.,卸掉吸头,一般用力下按吸头脱卸按纽即可卸掉吸头。将吸头丢弃到废物收集器中。移液器如不使用，将刻度调到最大量程，使弹簧恢复原形，延长移液器的使用寿命。,.,（一）实验目的：,1、使用专一的培养基（尿素为惟一氮源）分离专一的细菌（有脲酶的细菌）。2、使用指示剂（酚红）颜色的变化检知酶（脲酶）所催化的反应。,本实验的内容是：用尿素固体培养基从土壤中分离出能利用尿素的细菌，观察菌落数；并以LB全营养固体培养基为对照，观察全营养培养基上的菌落数。,二、实验内容,比较两者的菌落数，可知能利用尿素的细菌在土壤菌群中所占的比例,.,（二）实验原理：,在土壤中，存在一些细菌，它们含有脲酶，能分解尿素(脲)作为其生长的氮源(NH3),1.利用尿素培养基(以尿素为惟一氮源的选择培养基)，分离出土壤中含脲酶的细菌。,二、实验内容,2.细菌合成的脲酶能将尿素分解成NH3，致使PH升高，使酚红指示剂变红。,.,二、实验内容,（三）设备及用品：略,（四）材料,2、全营养LB固体培养基：蛋白胨、酵母提取物、NaCl、琼脂糖、水。,3、尿素固体培养基：葡萄糖、NaCl、K2HPO4、酚红、琼脂糖、水、尿素。,1、100mL烧杯：装有50mL70%酒精，浸泡着玻璃刮刀,6、土样：从有哺乳动物排泄物的地方取（粪便中含尿素，利于含脲酶的微生物生长）,4、5支有塞试管：盛有4.5mL蒸馏水,5、250mL三角瓶：盛有90mL蒸馏水,.,为什么要设置全营养LB固体培养基？,起对照作用。土壤中含有多种细菌，在全营养LB培养基中，多数细菌都能生长；而在仅以尿素为氮源的培养基中，只有含有脲酶的微生物才能生长。,1、为什么用琼脂糖替代琼脂作为固化剂？,酚红在此起什么作用？,琼脂是末被纯化的混合物，内含有一定量的含氮化合物。如果用琼脂固化培养基，会为细菌提供一定量的非尿素类氮源，这样会在尿素固体培养基上产生大量以非尿素为氮源的细菌，不利于以尿素为氮源的细菌的筛选。,酚红为酸碱指示剂，在酸性环境呈黄色，在碱性环境呈红色。通过酚红的颜色变化，可检测培养基中pH的变化。,思考与练习：,.,注意：取样时尽量只取悬液。,二、实验内容,（五）实验步骤：,1、配制培养基并灭菌,2、倒平板,3、制备细菌悬液,4、用涂布分离法分离细菌,5、细菌培养,6、观察、对比,全营养LB固体培养基和尿素固体培养基(除尿素外)均进行高压蒸汽灭菌；尿素固体培养基待冷却到60，加入用G6玻璃漏斗过滤的尿素溶液。,用10-4和10-5的土壤稀释液各浓度均做三个培养皿,培养基倒置培养，372448h。,实验组与对照组菌落数,制成10-2、10-3、10-4、10-5土壤稀释液,用移液器取0.1ml土壤稀释液,用涂布器涂布分离,.,二、实验内容,（六）实验结果：,10-4、10-5土壤稀释液尿素培养基上涂布结果,10-4、10-5土壤稀释液全营养LB培养基上涂布结果,这说明能利用尿素的细菌在土壤菌群中只占少数。因为人和其他哺乳动物产生的排泄物毕竟是少量的，且尿素还可以在高温下自然分解，因此，以尿素为氮源的菌群较少。,.,2.有脲酶的细菌在生态系统稳定上起什么作用？,3.有脲酶的细菌菌落周围为什么有着色的环带出现？,土壤中大量尿素的存在会对环境造成污染，如土壤板结、肥料利用率下降、地下水污染等。有脲酶的细菌能分解尿素，并利用所形成的氨，有利于自然界中的氮循环。,有脲酶的细菌向胞外分泌脲酶，使培养基中的尿素(中性)分解产生氨(碱性)，导致培养基中酚红指示剂变为红色。培养基中酸碱指示剂产生颜色变化(变红)，标志着存在脲酶分解尿素的作用，从而证明该菌株可以以尿素为氮源。红色环状区域的大小代表脲酶活性的强弱和含量的多少。红色区域越大，表明菌株利用尿素的能力越强。,思考与练习：,.,本实验的微生物分离与上一