生物大分子结构与功能第5章蛋白质的柔性结构

.,第五章：蛋白质的柔性结构,.,天然折叠的蛋白分子往往不是以一种构象状态存在的。在晶体结构中我们看到的往往仅是一种状态的构象，它是蛋白质分子的一个平均构象。实际上，蛋白质分子始终是处于一种呼吸的状态。蛋白质结构中所有的原子都在运动，这些原子的运动通常是随机的，但有时可以是集合性的运动。这种集合性的运动引起分子中的原子团在相同的方向上产生运动，造成蛋白质分子中的侧链可以从一种构象转化为另一种构象。某些环区域也并不总是固定在一种单一的构象状态，螺旋也可以互相产生滑动，完整的结构域之间也可以改变它们的堆积接触以打开或关闭结构域之间的距离。通常这些运动都是比较小的，有时小到仅有1/10的运动，但有时这种集合性运动可以很大，大到足以具有重要的生物学意义。,.,这样大的集合性运动在X-射线晶体学研究中所表现出来的是电子密度的水平低，甚至在某些情况下看不到电子密度的存在。产生这样的运动的区域通常在晶体学中被表述为柔性(flexibility)运动或无序(disorder)。,核磁共振实验对于这样的区域的测定可以作为一种互补，因为核磁共振实验可测出这些区域的各种不同的构象，通过理论计算也可以计算出这些分立的或集合性运动这叫作分子动力学模拟。,.,分子动力学模拟已经表明，每一个分立的残基的集合性运动仅在皮秒(10-12秒)的时间尺度，而环区域的运动在纳秒(10-9秒)的尺度。这种运动对于许多蛋白质的功能是非常重要的。象电子转移和配基结合或释放反应均以这样的时间尺度发生，并通常伴随着蛋白质原子的运动。例如，当肌红蛋白呼吸时，通道在溶剂和被包埋在分子内部的结合部位之间打开，以允许氧原子在纳秒的时间尺度范围与肌红蛋白结合或者释放出来。,除了蛋白质中原子小的呼吸运动之外，在分子的功能态之间也会发生大的构象变化。不同的pH和配基的存在和缺失以及环境中的微小的变化，往往能够稳定蛋白质的不同构象态。这些构象变化可以是活性部位的氨基酸侧链的构象变化到环区域的运动等。同时结构域之间的相对取向和寡聚蛋白中四级结构也会发生变化，这样的运动通常是与功能相关的。例如酶的催化，肌肉运动和能量转换等。,.,真核细胞周期的五个相(G0,G1,S,G2和M相),例1：细胞周期调节蛋白激酶的构象变化,在S相，DNA合成，DNA被复制并且染色体翻倍。在M相，有丝分裂父代细胞的二倍化染色体通过有丝分裂的纺锤体分开，这样每个子代细胞接收到相同组分的染色体。,一个细胞分裂的完整周期是MG1S和G2。通过G1S和G2相，细胞的蛋白质合成机器大分子和细胞器被建立起来，同时细胞的体积增大。在有丝分裂时，染色体和细胞质被分为两个相等的部分。此外，还有一个静止相G0相，发生在细胞的未分裂状态。,.,由cyclin的降解对CDKs的调节,细胞周期的进程取决于一系列的叫作cyclin依赖的蛋白激酶(cyclin-dependentproteinkinases,CDKs)的连续激活作用。,图中显示两种类型的cyclin-CDK复合物，一种是触发S相，另一种触发M相。在这两种情况下CDK的激活需要与cyclin的结合，它们的非活性依赖于cyclin的降解,在脊椎动物的细胞中至少有四种不同CDKs，控制着细胞周期的活动。不同的催化亚基都属于密切相关的基因家族，不同的CDK的一个或几个cyclin分子都是该家族的成员。CDKs作为一个延迟开关，控制着从G1相到S相从G2相到M相以及所有构成细胞周期的其它步骤,.,人的体细胞中调制DNA复制的CDK2-cyclinA的结构提供了详细的结构信息以及cyclinA激酶的功能。CyclinA的功能片段的晶体结构于1995年由LouiseJohnson实验室解出，非活性的CDK2的结构1993年已由Sung-hoKim实验室解出，活性的cyclinA片段与CDK2复合物的结构也于1995年由NicolaPavletich实验室解出。通过对这些结构的分析和结构比较，揭示出cyclinA是如何结合到CDK2上，并如何在CDK2的活性部位引起大的构象变化，使CDK2蛋白质从一种非活性的状态转变为活性状态的。而在此过程中cyclinA的结构则没有发生构象变化,cyclinA依赖型激酶CDK2的结构,cyclinA依赖型激酶CDK2有两个结构域，N-端结构域由一段螺旋折叠片组成，在螺旋中PSTAIRE的氨基酸顺序（红色）在所有的CDKs蛋白激酶中都是高度保守的；C-端结构域主要由螺旋组成，并含有一段柔性的环区域称作T-loop（黄色）环区域，含有一个苏氨酸残基，在完全活性的酶中该苏氨酸残基被磷酸化。,.,CyclinA的结构,CyclinA活性片段残基173-432的结构由两个非常相似的结构域构成。每个结构域都由五段螺旋组成。该活性片段的作用几乎与完整的cyclinA分子的作用相同。在所cyclinA中第一个结构域具有十分保守的氨基酸顺序被称作Cyclin-box，而第二个结构域的氨基酸顺序则不相同。因此尽管cyclinA片段的两个结构域结构几乎相同但仅有一个Cyclin-box序列。,.,活性的CDK2蓝色和cyclinA复合物的结构,在cyclinA-CDK2复合物中，主要是CyclinA与CDK2中的PSTAIRE螺旋和T-loop相互作用，cyclin-box螺旋2-6与CDK2的PSTAIRE深红色螺旋和T-loop黄色作用。在该复合物中，cyclinA的结构与单个cyclinA是相同的，而CDK2的结构则发生了很大的构象变化，包括PETAIRE螺旋T-loop和ATP的结合部位（浅红色）。,整个N端结构域相对于C端的结构域的取向发生了变化，此外PSTAIRE螺旋向CDK2的活性部位靠近并旋转了90，以便主要的催化残基Glu51指向裂缝，而不是象在单个的CDK2结构中那样远离此裂缝。,.,CDK2与cyclinA结合的构象变化,一旦与cyclinA结合，PSTAIRE螺旋橙色转动90，并改变位置以使得Glu51变为指向活性部位。该PSTAIRE螺旋的一些主链原子由于这种一致性运动位移了8.0的距离。T-loop发生了大的位置重排某些环区域上的氨基酸残基的位移可达20。,左图：在非活性态，PSTAIRE螺旋红色的取向使Glu51指向远离ATP的结合部位，而T-loop封住了与底物的结合部位，以阻止蛋白结合到CDK2上。右图：在活性的cyclinA-CDK2复合物结构中，PSTAIRE螺旋发生了重新定向以使得Glu51残基指向活性部位并与另一个与催化有关的残基Lys33形成盐键，T-loop改变了构象并与另一个残基Asp145一起与活性部位中的镁离子配位，此时底物的结合部位被打开，蛋白可以结合底物。cyclin-CDK2复合物可以磷酸化Ser/Thr残基并进而激活所结合的蛋白。在自由CDK2T-loop结构中的螺旋在复合物中变为一条链。,.,cyclin结合引起CDK2的结构变化,(a)活性部位位于N端结构域（蓝色）和C端结构域（紫色）之间的裂缝中，在非活性状态此活性部位被T-loop所封闭。,(b)在活性的cyclin结合状态的CDK2结构中,Tloop的结构发生了变化,活性部位被打开,Thr160适合于磷酸化.由于cyclinA的结合所引起的CDK2的构象变化,不仅暴露了活性部位的裂缝以使ATP和蛋白底物能够与之结合,而且活性部位的残基发生了重排,以形成酶的催化作用。此外Thr160被暴露出来，并准备被磷酸化以提高催化活性。简而言之蛋白质结构的柔性调节了CDK家族的酶活性，因而控制了细胞周期。,.,StructuralbasisofinhibitionofCDK-cyclincomplexesbyINK4inhibitors,PhilipD.Jeffrey,LilyTong,andNikolaP.PavletichCellularBiochemistryandBiophysicsProgramandHowardHughesMedicalInstitute,MemorialSloan-KetteringCancerCenter,NewYork,NewYork10021,USAGenesDev.200014:3115-3125,.,Thecyclin-dependentkinases4and6(Cdk4/6)thatdriveprogressionthroughtheG1phaseofthecellcycleplayacentralroleinthecontrolofcellproliferation,andCDKderegulationisafrequenteventincancer.Cdk4/6areregulatedbytheD-typecyclins,whichbindtoCDKsandactivatethekinase,andbytheINK4familyofinhibitors.,Thestructurerevealsthatp18-INK4cinhibitstheCDKcyclincomplexbydistortingtheATPbindingsiteandmisaligningcatalyticresidues.p18INK4calsodistortsthecyclin-bindingsite,withthecyclinremainingboundataninterfacethatissubstantiallyreducedinsize.TheseobservationssupportthemodelthatINK4bindingweakensthecyclinsaffinityfortheCDK.ThisstructurealsoprovidesinsightsintothespecificityoftheD-typecyclinsforCdk4/6.,.,Overallstructureofthep18Cdk6K-cyclincomplexandcomparisonwithCdk2cyclinASchematicviewofp18Cdk6K-cyclin.p18isshowninyellow,Cdk6incyan,K-cyclininpurple.TheTloopandPSTAIREelementsofCdk6arehighlightedinred,andthehelicesofthefirstcyclinrepeatarelabeled.NandCterminiarelabeledwherevisible.Thep18Cdk6andK-cyclinCdk6interfacesdonotoverlapandlieonoppositesidesofthekinase,buryingatotalof43502ofsurfacearea.(B)Topviewofthep18Cdk6K-cyclincomplex,approximatelyorthogonaltoviewinA.Theankyrinrepeatsofp18arenumbered.ThePSTAIREhelixiscentraltotheCdk6K-cyclininterface,buttheTlooppacksontheothersideofthekinase.(C)ViewofCdk2cyclinAcomplexsuperimposedontheClobeofCdk6inthesameorientationasinA.BoththePSTAIREhelixandTloop,inred,packagainstcyclinA.(D)ViewofsuperimposedCdk2cyclinAcomplexfromsameviewpointasB.,.,TheCdk6structureinthep18Cdk6K-cyclincomplexhasalargenumberofconformationalchangescomparedwiththeactiveconformationofCdk2(Jeffreyetal.1995;Fig.2C,D)orofotherproteinkinases.InthisinactiveCdk6structure,theNandClobesarerotated13awayfromeachother,resultinginthemisalignmentofATP-bindingresidues.TheN-lobePSTAIREhelix,whichcontainsaninvariantactivesiteresidue(Glu61),isdisplacedby4.5awayfromtheactivesiteandisrotatedby16.AC-lobeloop(Tloop,residues162182),whichcontainsthethreoninethatisphosphorylated(Thr177)onthefullactivationofthekinase(Morgan1995;Russoetal.1996)andthatformspartofthepolypeptidesubstrate-bindingsite(Brownetal.1999),isdisplacedby30.Finally,anadditionalloopatthebackofthecatalyticcleft(residues99102),whichwouldhydrogenbondtoATP,isdisplacedbyseveralngstroms.,.,TheCdk2cyclinAstructure(Jeffreyetal.1995)showedthatcyclinAbindingtoCdk2causedconformationalandpositionalchangesinthePSTAIREhelixandTloopandthatthesechangesactivatedthekinasebycorrectlyaligningcertainactivesiteresiduesandreorganizingthepolypeptidesubstratebindingsite.Inthep18Cdk6K-cyclincomplex,notonlydoestheK-cyclinfailtocarryoutmostoftheseconformationalchangesbutp18causesthemisalignmentofadditionalresiduesinvolvedinATPbindingandcatalysis.,.,StructureoftheCdk6K-cyclininterface,(A)ThePSTAIREhelixofCdk6isacentralfeatureoftheCdk6K-cyclininterface.TheviewpointshowncorrespondsapproximatelytothatinB.Threesetsofinteractionsareshown:hydrogenbondsbetweentheCdk6main-chainprecedingthePSTAIREhelixandtheconservedLysGlupairofK-cyclin(K106,E135);theconservedIle59ofCdk6insertsintoahydrophobicpocketinK-cyclin;residuesattheendofthePSTAIREhelix,oneturnlongerinCdk4andCdk6thaninCdk2,interactwithresiduesontheN-terminalhelixofK-cyclinandmayplayaroleincyclinCDKspecificity.(B)Surfacerepresentationofp18Cdk6K-cyclincomplexillustratingtheminimalinteractionsbetweenK-cyclinandtheCdk6Clobe.p18iscoloredyellow,theCdk6Nlobeiscyan,theCdk6Clobeisblue,andtheK-cyclinispurple.TheonlycontactsbetweenK-cyclinandtheClobeofCdk6arisefrominteractionswiththeN-terminalhelixofK-cyclin.(C)SurfacerepresentationofCdk2cyclinAintheequivalentorientationasthatinA,showingsignificantlygreaterinteractionsbetweentheClobeoftheCdk2andthecyclinA,givingrisetoamuchmoreextensivecyclinCDKinterface.,.,TheATP-bindingsiteofp18Cdkl6K-cyclinandCdk2cyclinA.ActivesiteresiduesimplicatedinATPbindingandcatalysisaredisplacedinthep18Cdk6K-cyclincomplexrelativetotheactiveCdk2cyclinAconformation.Cdk2andCdk6weresuperimposedontheirClobes.Cdk6isshownincyan,p18inyellow,Cdk2ingray.Movementofactivesiteresiduesisindicatedbyredarrows.p18displacestheNloberelativetotheClobe,causingthehydrophobicresidues(Ile19,Val27,Ala41,Leu152)thatsandwichtheadenineringofATPtomovebyupto4.5.Thep18inhibitoralsodistortstheedgeoftheactivesiteviaPhe82,affectinghydrogenbondinginteractionswiththeedgeoftheATPring.TherelatedshiftofthePSTAIREhelixontheothersideoftheactivesitedisplacesanactivesiteresidue(Glu61).TheTloopofCdk6divergesfromthatofCdk2betweenPhe164andVal181,TheINK4-inducedconformationalchangesinCdk6wouldinterferewiththebindingofATPandpolypeptidesubstrateandwouldalsomisalignanyweaklyboundsubstrateswithrespecttophosphotransfer.,.,ThedifferenceswithrespecttoCdk2cyclinAarisefromcontactsattheCterminusofthePSTAIREhelixcausedbyathreeresidueinsertioninCdk6(residues7072)resultinginoneadditionalhelicalturnof3.10type.ThelongerPSTAIREhelixofCdk6wouldcollidewiththeN-terminalhelixofcyclinA(Thr70andPhe71ofCdk6wouldclashwithMet189andTyr185ofcyclinA).ThelongerCdk6PSTAIREhelixisaccommodatedinK-cyclinbyasmallshiftoftheN-terminalhelixrelativetocyclinAandbythesubstitutionofsmalleraminoacids(Asn24ofK-cyclininsteadofTyr185ofcyclinA).ThisresultsincontactsbetweenThr70andPhe71intheCdk6insertionandAsn24,Ile28,andPhe32ofK-cyclin.,.,ThestructureofCdk6inthep18Cdk6K-cyclincomplexdiffersfromthestructureofcyclinA-activatedCdk2intheorientationoftheNandClobesofthekinaseandinthepositionsofthePSTAIREhelixandTloop.ComparedtotheCdk2cyclinAcomplex,thekinaseNandClobesofthep18Cdk6K-cyclincomplexarerotatedby13aboutanaxisthatpassesthroughthebackofthecatalyticcleftandisapproximatelyperpendiculartotheplaneoftheATPthatwouldbindthere.,TherotationoftheNlobeandthePSTAIREhelixawayfromtheClobeisalsoassociatedwiththeTloopnotadoptingtheconformationneededforsubstratebindingandkinaseactivity.IntheCdk2cyclinAcomplex,theTloopmakesmultiplecontactswiththePSTAIREhelix,thecyclin,andotherpartsoftheClobe.Asthesecontactswouldnotbepossibleinp18Cdk6K-cyclinbecauseofthemisalignmentofthelobesandPSTAIREhelix.,.,DespitetheoverallsimilaritiesintheNlobe-cyclininteractionsbetweentheinhibitedp18Cdk6K-cyclincomplexandtheactiveCdk2cyclinAcomplex,thereisalargedifferenceinthepositionandorientationofthecyclinrelativetothekinaseClobe.WhenthetwocomplexesarecomparedbysuperimposingtheirCDKClobes,K-cyclinisrotatedby40,anditscenterofgravityisshiftedby15relativetocyclinA.ThisiscausedinpartbytherotationbetweenthekinaseNandClobesinp18Cdk6K-cyclinandinpartbytherotationofthePSTAIREhelixrelativetotheNlobe.TheshiftinK-cyclinleadstoalackofsignificantcontactsbetweenK-cyclinandtheClobeandTloopofCdk6(Fig.4B).IntheCdk2cyclinAcomplex,thereareextensivecontactsbetweenthefirstcyclinrepeatandtheTloopandbetweentheN-terminalhelixandotherpartsoftheCdk2Clobe(Fig.4C;Jeffreyetal.1995).IntheinhibitedCdk6K-cyclincomplex,therearenocontactswiththeTloopandonlyafewminorcontactswiththeClobe.,.,ConformationofCdk6,SchematicrepresentationofthedifferentconformationsoftheCDK.CDKsundergoextensiveconformationalchangesonbindingofactivatingorinhibitingsubunits.ThemajordeterminantsofactivityarethepositionsandconformationofthePSTAIREhelixandTloop,aswellastherelativedispositionofthekinaseNandClobes.ThePSTAIREhelixadoptsapositionfurtherawayfromthecatalyticcleftininactiveCDKs(labeledasout)thaninactiveCDKs(in).ThePSTAIREhelixconformationcorrelateswiththelocationofaconservedactivesiteresidue(Cdk2,Glu51;Cdk6,Glu61)eitherinsideoroutsidethecatalyticcleft.,.,例二：肽与钙调蛋白(Calmodulin)的结合,钙调蛋白是一个含有148个氨基酸残基的钙结合蛋白，它与钙依赖性的信号通道的过程有关。钙调蛋白可结合到多种蛋白中，像激酶钙泵蛋白，以及一些运动性蛋白等，以调节这些蛋白的活性。这些蛋白的钙调蛋白结合区域大约由20个相邻的残基组成，虽然它们的氨基酸顺序变化很大，但它们都有形成螺旋的强烈倾向，单个的和与多肽结合的钙调蛋白的结构表明，多肽的结合引起了钙调蛋白分子中大的构象变化。,Calmodulin(CaM)(anabbreviationforCALcium-MODULatedproteIN)isacalcium-bindingproteinexpressedinalleukaryoticcells.Itcanbindtoandregulateanumberofdifferentproteintargets,therebyaffectingmanydifferentcellularfunction.,.,CaMmediatesprocessessuchasinflammation,metabolism,apoptosis,smoothmusclecontraction,intracellularmovement,short-termandlong-termmemory,nervegrowthandtheimmuneresponse.CaMisexpressedinmanycelltypesandcanhavedifferentsubcellularlocations,includingthecytoplasm,withinorganelles,orassociatedwiththeplasmaororganellemembranes.ManyoftheproteinsthatCaMbindsareunabletobindcalciumthemselves,andassuchuseCaMasacalciumsensorandsignaltransducer.CaMcanalsomakeuseofthecalciumstoresintheendoplasmicreticulum,andthesarcoplasmicreticulum肌浆网.CaMundergoesaconformationalchangeuponbindingtocalcium,whichenablesittobindtospecificproteinsforaspecificresponse.CaMcanbinduptofourcalciumions,andcanundergopost-translationalmodifications,suchasphosphorylation,acetylation,methylationandproteolyticcleavage,eachofwhichhaspotentialtomodulateitsactions.Calmodulincanalsobindtoedemafactortoxinfromtheanthrax炭疽bacteria.,.,与肽结合的钙调蛋白的构象变化,(a)在自由状态下钙调蛋白是一个由两个结构域（红色和绿色）组成的哑铃状分子。每个结构域都有两个与钙结合的EF手（EF-hand）(b)在结合肽的状态，螺旋连接子-helixlinker已被切开，分子的两端紧靠在一起，并形成一个致密的球状复合物。每个结构域的内核结构基本上没有变化，结合肽形成一段螺旋，每个结构域内含有两个EF手，每个EF手结合一个钙离子。这两个结构域显然在空间上是互相靠近的，并在螺旋连接子的两端分开。,当钙调蛋白与它的配基结合时实际上仅有5个基团改变了构象。这是螺旋连接子中的5个保守残基，这5个残基发生了解旋并形成一个环区域，虽然在此环区域之后仍是一个螺旋，但其方向发生了很大的变化。第二个螺旋以完全不同的取向与第一个螺旋靠近多肽，构象如此小的局部变化引起了如此大的结构域之间的变化，这是由配基引起蛋白变化的最大的一种蛋白。,.,Thereare4helix-loop-helix(EF-hand)motifs,.,Uponbindingofsometargetsequencestocalmodulin,thetwodomainscometogethertoformahydrophobicchannel,Calmodulinisonlyactivewhenallfoursitesarefilled.,ThebindingofthefourCa+ionsiscooperative,.,Mechanism:CalciumisboundviatheuseoftheEFhandmotif,whichsuppliesanelectronegativeenvironmentforioncoordination.Aftercalciumbinding,hydrophobicmethylgroupsfrommethionineresiduesbecomeexposedontheproteinviaconformationalchange.Thispresentshydrophobicsurfaces,whichcaninturnbindtoBasicAmphiphilic两性的Helices(BAAhelices)onthetargetprotein.Thesehelicescontaincomplementaryhydrophobicregions.TheflexibilityofCalmodulinshingedregionallowsthemoleculetowraparounditstarget.Thispropertyallowsittotightlybindtoawiderangeofdifferenttargetproteins.,.,CalmodulinwrapsaroundatargetdomainofsomeproteinsonlyafterbindingCa+.Otherproteinshaveboundcalmodulinaspartoftheirquaternarystructure,evenintheabsenceofCa+.Ineithercase,aconformationalchangeinducedbybindingofCa+tocalmodulinalterstheactivityofthetargetprotein.,.,CAMishighlyconservedacrossalleukaryotes,.,Onceinthecytosol,theCa+typicallybindstoasmallprotein,calmodulin.OncefourCa+bindtocalmodulin,itactivatesspecificproteinsinsidethecell,sucharecertainproteinkinases.,.,.,Ca2+-independentbindingofcalmodulintoitstargetproteinsbycontrast,usesaconsensussequence(IQxxxRGxxxR)calledanIQmotif.SomeproteinsbindcalmodulinthroughtheirIQmotifsatlowconcentrationsofCa2+.AsubsequentincreaseintheCa2+concentrationinducesaconformationalchangeintheboundcalmodulin,regulatingtheactivityofthetargetprotein.,HowdoesCalmodulinbindtoprote