中国药科大学生物技术生物工程微生物工程课件

微生物工程,第一节概述,一、微生物工程的概念及发展1、概念微生物工程(microbialengineering)是一门利用微生物的生长和代谢活动来生产各种有用物质的工程技术。,2、发展简史第一阶段传统的微生物发酵技术天然发酵不知什么是微生物，却在生活实践中利用自然的发酵现象来生产食品。如酒、酱等的家庭作坊式生产，时常被染杂菌困扰，不能控制。,第二阶段第一代微生物发酵技术纯培养技术的建立纯培养技术：用培养基培养纯的微生物。1857年，法国的巴斯德指出发酵现象是由微小生命体进行的化学反应。1905年，德国的柯赫发明了固体培养基，使天然发酵转为纯培养，污染现象减少。,第三阶段第二代微生物发酵技术深层培养技术抗生素：是生物（微生物、植物和动物）在其生命活动中产生，并能在低浓度下有选择的抑制或杀灭其它微生物或肿瘤细胞的有机物质。,第四阶段第三代微生物发酵技术微生物工程运用现代生物技术DNA重组和原生质体融合技术，有控制有目的的进行生产产品。,二、微生物工程的一般过程,（一）菌种的选育与菌种保藏,土样的采取,预处理,培养,菌落的选择,菌种的鉴定,目的：高效地获取一株高产目的产物的微生物,菌种保藏,（1）细菌,是自然界分布最广、数量最多的一类微生物。,微生物工程常用的微生物,工业生产常用的细菌有:乳酸杆菌属芽孢杆菌属醋酸杆菌属大肠杆菌属,（2）酵母菌,工业上用的酵母菌有:啤酒酵母、假丝酵母、毕赤酵母等,（3）霉菌,凡生长在营养基质上形成绒毛状、网状或絮状菌丝的真菌统称为霉菌。工业上常用的霉菌有根霉、曲霉等。,（4）放线菌,产生抗生素,（5）担子菌担子菌资源的利用正引起人们的重视，如多糖、橡胶物质和抗癌药物的开发。,（6）藻类,1、菌种的分离,稀释分离法划线分离法,2、菌种的筛选,自然选育诱变育种,3、菌种的保藏斜面低温保藏法液体石蜡封存法甘油冷冻保藏法冷冻干燥保藏法液氮超低温保藏法其他干燥保藏法,斜面低温保藏法4，36个月,液体石蜡封存法13年,甘油冷冻保藏法冻存在-70-80度，可以保存35年,冷冻干燥保藏法510年液氮超低温保藏法需要加入甘油等保护剂,（二）培养发酵控制发酵条件如营养物浓度、温度、pH、压力、溶解氧浓度等,（三）发酵产品下游的加工过程,发酵产物不同，分离提纯的方法会有所不同，产物分离、提纯的一般方法是：代谢产物：蒸馏、萃取、离子交换等方法。菌体本身：过滤、沉淀。,（四）废弃物的处理包括三部分：原料处理过程剩下的废渣产品分离与纯化提取过程剩下的废渣、细胞生产过程中的洗涤水、冷却水,生化需氧量（BOD）：指在规定条件下，微生物分解存在水中的某些可氧化物质，特别是有机物所进行的生物化学过程中消耗溶解氧的量。化学需氧量(COD)：指着一定条件下，水中的还原性物质在外加强氧化剂作用下，被氧化分解所消耗氧化剂的数量。,三、微生物工程的特点与化学工程相比（1）通过选育可以获得高性能菌种，提高产能（2）反应条件温和，通常在常温常压下进行（3）能够进行复杂的反应过程，且多个反应可同时进行（4）发酵产物通常为可降解的有机物质,存在的问题：（1）提取和精制困难（2）生产过程影响因素多（3）生产前准备工作量大，花费高，相对化学反应，反应器效率多。（4）发酵废水具有较高的BOD和COD，需处理后排放。,培养基：广义上讲培养基是指一切可供微生物细胞生长繁殖所需的一组营养物质和原料。同时培养基也为微生物培养提供除营养外的其它所必须的条件。,发酵培养基,发酵培养基的作用：,满足菌体的生长促进产物的形成,第二节微生物细胞培养技术,发酵培养基的要求,培养基能够满足产物最经济的合成。发酵后所形成的副产物尽可能的少。培养基的原料应因地制宜，价格低廉；且性能稳定，资源丰富，便于采购运输，适合大规模储藏，能保证生产上的供应。所选用的培养基应能满足总体工艺的要求。,（一）碳源,1、作用,提供微生物菌种的生长繁殖所需的能源和合成菌体所必需的碳成分,2、来源,糖类、油脂、有机酸、正烷烃,一、培养基的组成,3、工业上常用的糖类,葡萄糖,所有的微生物都能利用葡萄糖但是会引起葡萄糖效应,工业上常用淀粉水解糖,但是糖液必须达到一定的质量指标,糖蜜,是制糖工业的副产物。主要含有蔗糖，总糖可达50%75%注意：糖蜜含有较多的杂质，有些需要进行预处理。,淀粉、糊精,使用条件：微生物必须能分泌水解淀粉、糊精的酶类,缺点：难利用、发酵液比较稠。,优点：来源广泛、价格低、可以解除葡萄糖效应,（二）氮源,氮源主要用于构成菌体细胞物质，常用的氮源可分为两大类：有机氮源和无机氮源。,1、有机氮源,成分复杂：除提供氮源外，有些有机氮源还提供大量的无机盐及生长因子。,例玉米浆：可溶性蛋白、生长因子（生物素）、苯乙酸较多的乳酸硫、磷、微量元素等,种类：氨盐、硝酸盐和氨水,特点：微生物对它们的吸收快，所以也称之谓迅速利用的氮源。但无机氮源的迅速利用常会引起pH的变化如：(NH4)2SO42NH3+2H2SO4NaNO3+4H2NH3+2H2O+NaOH,2、无机氮源,选择合适的无机氮源有两层意义：满足菌体生长稳定和调节发酵过程中的pH,氮源使用的一些相关问题：,有机氮源和无机氮源应当混合使用,早期：容易利用易同化的氮源无机氮源中期：菌体的代谢酶系已形成、则利用蛋白质,有些产物会受氮源的诱导和阻遏,有机氮源选取时也要考虑微生物的同化能力,开发效果好、有针对性的有机氮源仍然是令人感兴趣的课题,（三）无机盐和微量元素,1、作用：各种不一样,2、来源：C、N源，以盐的形式补充,3、用量：根据具体的产品，以实验决定,4、使用注意点,A.对于其它渠道有可能带入的过多的某种无机离子和微量元素在发酵过程中必须加以考虑,例：铁离子青霉素发酵中，铁离子的浓度要小于20g/ml发酵罐必须进行表面处理,B、使用时注意盐的形式（pH的变化）,（四）生长因素和发酵刺激物,从广义上讲，凡是微生物生长不可缺少的微量的有机物质，如氨基酸、嘌呤、嘧啶、维生素等均称生长因子。,1、生长因素,2、前体,青霉素：分子量356,苯乙酸:分子量136,作用：前体有助于提高产量和组分,用法：前体使用时普遍采用流加的方法前体一般都有毒性，浓度过大对菌体的生长不利（苯乙酸，一般基础料中仅仅添加0.07%)前体相对价格较高，添加过多，容易引起挥发和氧化.流加也有利于提高前体的转化率,3、发酵刺激物,产物促进剂：是指那些非细胞生长所必须的营养物，又非前体，但加入后却能提高产量的添加剂。,（五）水,水源质量的主要考虑参数包括pH值、溶解氧、可溶性固体、污染程度以及矿物质组成和含量。,按组成物质来源,合成培养基:原料其化学成分明确、稳定,适合于研究菌种基本代谢和过程的物质变化规律,培养基营养单一，价格较高，不适合用于大规模工业生产,天然培养基:采用天然原料,原料来源丰富(大多为农副产品)、价格低廉、适于工业化生产,原料质量等方面不加控制会影响生产稳定性,二、培养基的种类,按状态,固体培养基:用于菌种的培养和保存，是在液体培养基中加入凝固剂配成。也广泛应用于有子实体的真菌类，如香菇、白木耳等的生产。,半固体培养基:即在配好的液体培养基中加入少量的琼脂，一般用量为0.5%0.8%,主要用于微生物的鉴定。,液体培养基:80%90%是水，其中配有可溶性的或不溶性的营养成分，是发酵工业大规模使用的培养基。,按用途（从发酵生产应用考虑）培养基按其用途可分为孢子（斜面）培养基、种子培养基和发酵培养基三种,三、灭菌指用化学的或物理的方法杀灭或除掉物料或设备中所有的生命有机体的技术或工艺过程。,常用的方法有加热灭菌法、辐射灭菌法、介质过滤除菌法、化学灭菌法,（一）加热灭菌法是发酵工业中最常用的灭菌方法。分为湿热灭菌和干热灭菌法。湿热灭菌法直接蒸汽灭菌，蒸汽冷凝时释放大量潜热，并具有强大的穿透力，在高温和水存在时，微生物细胞中的蛋白质极易发生不可逆的凝固性变性，短时间内杀死微生物。,干热灭菌指在干燥高温条件下，微生物细胞内的各种与温度有关的氧化反应速度迅速增加，使微生物的致死率迅速增高的过程。,（二）辐射灭菌法,是利用高能量的电磁辐射和微粒辐射来杀灭微生物。紫外线：作用于微生物的核酸，对营养细胞和芽孢均有效，但穿透力低，只适于表面灭菌。X射线和射线:使菌体内的水和有机物产生强烈的离子化反应，阻碍微生物代谢活动而导致菌体迅速死亡。,（三）介质过滤除菌法是用过滤方法除去活的或死的微生物的方法。主要用于对热不稳定的药物溶液、气体、水的灭菌。,（四）化学灭菌法是通过药剂与微生物细胞接触而发生诸如蛋白质变性等作用而达到杀灭微生物的目的。常用药剂：甲醛、苯酚、高锰酸钾,四、微生物的培养方法根据培养基的性质可分为固体培养和液体培养,（一）固体培养法,1、斜面培养法常用于菌种复壮和暂时保存。,2、平板培养法常用于菌种分离,3、穿刺培养法常用于厌气菌的保藏,（二）液体培养法,1、静置培养法,2、振荡培养法,3、通气搅拌培养法液体发酵,发酵罐示意图,厌氧发酵：适用于厌氧或兼性厌氧微生物的发酵，如丙酮丁醇发酵、酵母菌的酒精发酵、乳酸发酵等好氧发酵：适用于好氧微生物的发酵，如链霉素、谷氨酸、柠檬酸等的发酵,根据是否需要氧气可分为厌氧发酵和好氧发酵,（一）分批培养指在发酵过程中，除了不断进行通气（好氧发酵）和为调节发酵液的pH而加入酸碱溶液外，与外界没有其它物料交换的一种发酵方式。培养基的量一次性加入，产品一次性收获，是目前广泛采用的一种发酵方式。,根据投料方式的不同可分为分批培养、补料分批培养、半连续培养和连续培养。,分批培养中微生物的生长,迟滞期,对数生长期,稳定期,死亡期,优点操作简单，周期短，染菌机会少，生产过程和产品质量容易掌握缺点产率低，不适于测定动力学数据,（二）连续培养指连续不断地向反应器（发酵罐）中流加新鲜发酵液，同时又连续不断地排出发酵液，从而使pH、养分、溶解氧等保持恒定，使微生物的生长和代谢活动保持旺盛稳定状态的一种发酵方式。,单罐连续发酵,优点高效，产品质量较稳定，节约能源。缺点菌种不稳定的话，长期连续培养会引起菌种退化，降低产量。长时间补料染菌机会大大增加。,（三）补料分批培养是指在微生物分批发酵过程中，以某种方式向发酵系统中补加一定物料，但并不连续地向外放出发酵液的发酵技术，是介于分批发酵和连续发酵之间的一种发酵技术。,（四）半连续培养在补料分批培养的基础上间歇放掉部分发酵液称为半连续培养。,五、发酵过程的控制,（一）物理参数,压力,温度,搅拌转速,空气流量,物理参数,温度,温度对发酵的影响：1、温度影响反应速率2、温度影响发酵方向最适温度的选择：1、根据菌种及生长阶段选择2、根据培养条件选择3、根据菌生长情况,（二）化学参数,基质浓度,溶解氧浓度,氧化还原电位,产物的浓度,废气中的氧浓度,化学参数,pH值,废弃中的CO2浓度,pH值,发酵过程pH变化的原因（1）基质代谢糖代谢、氮代谢、生理酸碱性物质利用后pH会上升或下降（2）产物形成（3）菌体自溶，pH上升，发酵后期，pH上升,pH对发酵的影响（1）pH影响酶的活性（2）pH值影响微生物细胞膜所带电荷的改变（3）pH值影响培养基某些成分和中间代谢物的解离，从而影响微生物对这些物质的利用（4）pH影响代谢方向,pH的控制(1)调节好基础料的pH(2)在基础料中加入维持pH的物质(3)通过补料调节pH(4)当补料与调pH发生矛盾时，加酸碱调pH(5)不同调pH方法的影响(6)发酵的不同阶段采取不同的pH值,基质浓度基质就是发酵液中的各种营养物质，基质浓度指发酵液中糖、氮、磷等重要营养物质的浓度,溶解氧浓度溶解氧浓度一般用绝对含量10-6（g/ml）表示，有时也用在相同条件下，氧在培养液中饱和度的百分数来表示。明显下降的原因：（1）污染了需氧性杂菌。（2）菌体代谢发生了异常，消耗氧增多（3）某些设备或者工艺控制出现故障,氧化还原电位也是控制发酵过程的参数之一。氧化还原电位的适宜值和微生物的种类还有生理状态有关。产物的浓度衡量产量的高低或判断合成代谢是否正常。也是决定发酵周期长短的根据。,废气中的CO2浓度测定废气中的CO2可以算出产生菌的呼吸熵，从而了解产生菌的呼吸代谢规律。,（三）生物参数,菌丝形态,菌体浓度,发酵过程中泡沫产生的原因（1）通气搅拌的强烈程度（2）培养基配比与原料组成（3）菌种、种子质量和接种量（4）灭菌质量,（四）泡沫的影响与控制,起泡的危害：降低生产能力引起原料浪费影响菌的呼吸引起染菌,消除泡沫的方法机械消沫原理：靠机械力引起强烈振动或者压力变化，促使泡沫破裂，或借机械力将排出气体中的液体加以分离回收。,化学消沫原理：当泡沫的液膜具有较大的表面粘度时，可以加入某些分子内聚力较小的物质，以降低液膜的表面粘度，使液膜的液体流失，导致泡沫破裂天然油脂类消泡剂、聚醚类消泡剂、醇类消泡剂、硅酮类消泡剂,第三节微生物菌种选育及原生质体技术,一、菌种选育的理论基础,遗传型变异表型变异,二、菌种选育的经典方法,（一）自然选育自然状态下，碱基对发生自然突变的机率为10-810-9,（二）诱变育种,1、出发菌株的选择,1,2,3,4,应考虑的问题,具备某种优良特性,对诱变剂敏感,出发菌株的稳定性,菌种的生理状态及生长发育时间,2、诱变处理,诱变处理,（1）物理诱变：紫外线、快中子、射线、射线、射线、激光。（2）化学诱变引起DNA结构改变的一些化学物质。按照与DNA作用的方式分为三类：烷化剂、碱基类似物、移码诱变剂（3）生物诱变噬菌体可以作为诱变剂用于抗噬菌体的菌种的选育,（4）诱变剂量的选择,（5）增变剂的使用,3、突变株的筛选,随机筛选,筛选,半理性化筛选,（1）随机筛选随机筛选即菌种经诱变处理后，进行平板分离，随机挑选单菌落，从中挑选高产菌株。（2）半理性化筛选根据产物已知的或可能的生物合成途径、代谢调控机制和产物分子结构来进行设计和采用的筛选方法。,诱变育种工作中几个应注意的问题：A选择好出发菌株B复合诱变因素的使用C剂量选择D变异菌株的筛选E高产菌株的获得需要筛选条件的配合,原生质体（protoplast)：动植物和微生物细胞去除细胞壁以后的一种细胞结构。三条标准（1958年Brenner)：没有细胞壁失去细胞刚性，成球形对渗透压敏感脆弱,三、原生质体融合,原生质体融合用脱壁酶处理将微生物细胞壁除去，制成原生质体，再用聚乙二醇（PEG）促进原生质体发生融合，从而获得融合子。,（五）融合子的选择,（四）原生质体的再生,（三）原生质体的融合,（二）原生质体的制备,（一）标记菌株的筛选,（二）原生质体的制备,6.渗透压稳定剂,5.酶解时间,4.酶解温度,3.酶浓度,2.菌体的培养时间,1.菌体的预处理,（三）原生质体的融合,原生体在诱融剂或正弦电场作用下凝集，彼此靠近两个相邻原生质体之间的质膜相互融合，两亲本原生质体质膜上的受体、糖蛋白、糖脂等成分也在融合后的质膜上重新分布,PEG诱导融合的原理,PEG是带负电的高分子化合物，在原生质体融合中起到一种桥梁作用，可以使原生质体凝集，洗脱过程中PEG可被洗掉，导致质膜表面电荷重排。粘连的质膜大面积紧密相连，电荷的重排导致一个原生质体的负性电荷部位和另一原生质体的正性电荷部位相连而导致融合。,PEG诱导融合,1.融合频率高2.可重复性强3.诱发融合无特异性4.毒性较低,电融合技术,利用