微生物工程课件第八章工业发酵和控制

,微生物工程,第八章工业发酵和控制,举例,青霉素发酵,产青霉素,生长,30,25,产目的蛋白,生长,37,40,杂交瘤细胞发酵,目的产物,生长,37,45,基因工程菌ECOLI发酵,举例；,四环素合成,金霉素合成,金霉素合成,四环素合成,金色链霉菌,35,30,表面张力,表面张力是造成液体表面收缩状态的力，各种液体的表面张力大小不同。液体的表面张力越大，泡沫越稳定。,液体粘度,液体的黏度越大，气泡液膜的黏度也大，则泡沫稳定。因为较大的表观黏度可以减缓气泡间液膜的液体流失，使气泡稳定。但黏度太大，膜中起泡剂分子不能自由运动，膜局部受损时，不能及时弥和“伤口”，反而使泡沫易碎。,泡沫的机械强度,泡沫的机械强度取决于起泡物质分子在气泡表面的排列方式、分子间作用力及氢键的大小等。起泡物质在水中，其分子的极性端向着水，而非极性端向着空气，分子就这样力图在表面层做定向排列，使泡沫的机械强度增加。当起泡剂在气泡表面上恰好排列成单分子层时，泡沫的机械强度最大。起泡剂分子的链越长，链间的范德华引力也越大，泡沫的机械强度也越大。蛋白质分子间，除了范德华引力外，在羧基和氨基之间尚有氢键引力，也加强了气泡的机械强度。,化学消泡,1）化学消泡的机理:表面活性剂，可以降低液体的表面张力，使气泡膜局部的表面张力降低，张力的平衡受到破坏.当泡沫表面层存在着极性表面活性物质形成的双电层时，加入带相反电荷的表面活性剂，可以中和电性；或与发酵液中的起泡剂（如蛋白质等）争夺液膜上的空间，使液膜的机械强度降低，导致泡沫破裂。当泡沫的液膜具有较大的表面粘度时，加入某些分子内聚力较弱的物质，可降低液膜的表面粘度，从而促使液膜的液体流失而使泡沫破裂。,2)、化学消泡的性能和特点,化学消泡剂应具有以下的特点：化学消泡剂必须是表面活性剂，具有较低的表面张力，消泡作用迅速有效；具有一定的亲水性，以使消泡剂对气一液界面的分散系数足够大，从而迅速发挥消泡活性；在水中的溶解度必须较小，以保持持久的消泡或抑泡性能；对人、畜及微生物细胞无毒性，从而不影响发酵过程中的微生物生长和代谢，不影响产物的提取分离和产品质量；不影响氧在培养液的溶解和传递；必须来源方便、广泛，价格便宜,3）工业消泡剂的种类和特点,天然油脂类：天然油脂类化学消泡剂主要有玉米油、米糠油、豆油、菜油、棉子油及鱼油、猪油等；由于油脂类分子中无亲水集团，在发酵介质中难于铺展，所以消泡能力差。高级醇类：生产上应用的高级醇类有聚二醇、十八醇、三丁基磷酸酯等。聚醚类：用较多的有聚氧丙烯甘油、聚氧乙烯氧丙烯甘油、聚环氧丙烷、环氧乙烷甘油醚等。聚氧丙烯甘油（GP）和聚氧乙烯氧丙烯甘油（GPE），它们以一定比例配制的消沫剂又称“泡敌”。消沫能力是天然植物油的10倍以上，对细胞生长无害此外还具有性能稳定、操作简便、容易控制、用量少而成本低等优点。硅酮类：硅酮类消泡剂主要是聚二甲基硅氧烷及其衍生物,3）、工业消泡剂使用,通过机械分散或借助某些载体或分散剂，使消泡剂更易于在发酵液中进行分散；将消泡剂与载体一起使用，使消泡剂溶于或分散于载体中，两者并用可产生明显的增效作用。多种消泡剂并用可增强消泡作用，如用0.53的硅酮、2030的植物油、510的聚乙醇二油酸酯、14的多元醇脂肪酸与水组成的混合消泡剂具有明显的消泡增强效果；利用乳化剂增强消泡剂的消泡作用。如消泡剂聚氧丙烯甘油用吐温-80为乳化剂增效作用可提高l一2倍。同样用量的消沫剂少量多次的持久效果与少次多量的大不一样。少量多次或滴加可以收到有效防止泡沫产生和节省用量的双重效果。,第八章不同因素对发酵影响和控制,第一节温度对发酵的影响和控制第二节PH对发酵的影响和控制第三节氧对发酵的影响第四节二氧化碳对发酵影响和控制第五节泡沫对发酵的影响和控制第六节基质浓度对发酵的影响和控制,一、温度对发酵的影响及其调节控制,1、温度对微生物生长和产物形成的影响A、M处于不同的生长阶段对T反应不同；而不同的温度范围对M影响也不同。B、M对低温的适应力要高于对高温的适应力。C、各种微生物在一定的条件下都有一个最适的生长温度范围，细胞生长和代谢产物积累的最适温度往往不同。举例：D、温度通过酶反应影响发酵产物：升高，酶反应的速度越大，微生物细胞的生长代谢加快，产物生成提前，但很容易因热的作用而失去活性，酶失活也越快，表现出微生物细胞容易衰老，使发酵周期缩短，影响发酵过程最终产物产量。E、温度还会影响到微生物细胞的生物合成方向。举例F、温度可以通过改变培养液的物理性质而间接影响到微生物细胞的生长。,一）、温度对发酵影响及其调节控制续,2影响发酵温度的因素(发酵热：发酵过程中释放出来净热量)A生物热：1）M细胞在生长繁殖过程中本身产生的大量热，主要来源于培养基中碳水化合物、脂肪和蛋白质等分解释放出来的能量。一部分用于合成细胞内的高能化合物，供微生物细胞合成和代谢活动的需要，一部分用于合成代谢产物，剩余以热的形式散发出来。2）生物热的产生具有强烈的时间性和阶段性。初期，M处在适应期，细胞数量少，呼吸缓慢，产热较少；对数生长期，繁殖旺盛，呼吸作用激烈，细胞数较多，产热多，培养液温度升高较快；发酵后期，M已基本上停止繁殖，逐步衰老，产生的热量不多，温度变化不大，且逐渐减弱。3）一般M对营养物质利用的速度越快，营养成分越丰富，生物热就越大。,发酵对温度的影响,B、搅拌热：机械搅拌通气式发酵罐，搅拌带动液体作机械运动，造成液体之间、液体与设备之间发生摩擦，摩擦产生的热量散发在发酵液中，形成搅拌热。Q搅拌（PV）3600C、蒸发热：在通气培养过程中，被空气或水蒸汽带至大气中这部分热量称为蒸发热。D、辐射热：由于酵罐温度与罐外环境温度不同，发酵液通过罐体向外辐射的热量。辐射热的大小取决于发酵罐内外温度差的大小。辐射热受环境温度变化的影响，冬天影响大一些，夏季影响小些。,二）、最适温度选择与发酵温度控制,1、最适温度的选择A、发酵温度的选择还与培养基成分和浓度有关。当使用较稀或较容易利用的培养基时，提高温度往往会使营养物质过早耗尽，从而导致微生物细胞过早自溶，使产物的产量降低。B、发酵温度的选择还要参考其他的发酵条件，灵活掌握。2、发酵温度的控制A、一般说来，接种后应适当提高T，以利于孢子的萌发或加快微生物的生长繁殖，而且此时发酵T大多数是下降的；随着发酵液逐渐上升，温度应控制在最适生长温度；到主发酵旺盛阶段温度的控制可比最适生长温度低些，即控制在代谢产物合成的最适温度；到发酵后期，温度出现下降的趋势，直至发酵成熟即可放罐。,发酵温度控制续,B、耐高温微生物，即在较高的温度下进行生长和繁殖，对生产是有利的，可减少杂菌污染机会和降温辅助设备，培育耐高温菌种有意义。C、工业发酵过程一般无须加热，因为释放的发酵热常常超过M的最适生长温度，所以需要冷却的情况较多。通常是利用发酵罐的热交换装置进行降温，冬季发酵时空气还需进行加热处理，以便维持发酵的正常温度。,第二节、pH对发酵的影响及控制,一、pH对发酵过程的影响A、pH影响生长繁殖和代谢物形成的机理pH影响M原生质膜的电荷分布，引起原生质膜对个别离子通透性的改变，影响营养物质的吸收利用以及代谢产物的分泌。pH直接影响内酶的活性。在不适宜的pH值下，微生物细胞中的某些酶活性会受到抑制。pH影响培养基中某些重要营养物质和中间代谢产物的解离状态。影响微生物对这些物质的吸收和利用，引起微生物的代谢过程的改变，对代谢产物的质量和产量产生影响。,二、发酵过程中pH值的变化规律,微生物细胞生长阶段，相对于接种后的起始pH值来说，发酵液的pH值有上升或下降的趋势；在生产阶段，一般发酵液的pH值趋于稳定，维持在最适合产物形成的pH值范围；随着培养基中营养物质的耗尽，微生物细胞进入自溶阶段，随着培养液中氨基氮等的增加，pH值会有上升趋势。,一些发酵过程中pH值的变化规律,丙酮丁醇菌生长的最适pH值为5.57.0，而发酵产物的形成最适pH值为4.35.3；青霉素产生菌生长的最适pH值为6.67.2，而青霉素合成的最适pH值却为6.77.3；链霉素产生菌生长的最适pH值为6.36.9，而链霉素合成的最适pH值为6.77.3黑曲霉在pH值23的情况下，发酵过程形成的产物是柠檬酸；而在pH值接近中性时，却生成草酸。酵母菌在pH值为4，发酵产物主要是酒精；但在pH值8时，发酵产物除酒精外，还有醋酸和甘油。,二）、发酵中pH值变化原因及控制,1、发酵过程中pH值变化原因培养基中的碳氮比例不当。碳源过多，特别是葡萄糖过量或者中间补糖过多或溶解氧不足，致使糖等物质的氧化不完全，培养液中有机酸大量积累，使pH下降；氮源过多，氨基氮释放使pH上升。若加入过多的消泡油，pH下降；中间补料液中加入过多的氨水或尿素等碱性物质，使发酵液的pH上升。微生物生理酸性物质的存在，使pH下降；生理碱性物质的存在使pH上升。,三）、pH值控制基础,要考虑发酵动力学类型，一般考虑最适pH值与M生长和产物形成的关系类型：1）菌体比生长速率（u）和产物比生产速率（Up）最适PH都在一个相似的范围内，可整体控制。2）比生长速率的最适pH范围较宽，而Up的最适pH范围较窄，要以满足后者为高控制。3）两者对PH值变化都很敏感，且最适值相似，要严格控制在特定值。4）两者最适值不同，要分别或分阶段予以满足，以最大限度提高产率。,四）、发酵pH控制方法,随时检测pH值的变化情况，根据发酵过程中pH值变化规律，选用适当的方法对pH值进行适当的调节和控制调节培养基的原始pH值。或加入缓冲溶液制成缓冲能力强的培养基；或使盐类和碳源等的配比平衡。在发酵过程中加入弱酸或弱碱进行pH值的调节；也可通过调整通风量来控制pH值。如果仅用酸或碱调节pH值不能改善发酵情况时，进行补料是一个较好的办法，它既调节pH，又可补充营养，增加培养液的浓度和减少阻遏作用，进一步提高发酵产物的产率。补料调节在工业发酵过程中已取得了明显的效果。,发酵pH控制方法续,采用生理酸性铵盐作为氮源，会引起发酵液pH值的下降，可在加入碳酸钙来调节pH值。发酵过程氨水可调节pH，同时又补充氮源。氨水作用快，对发酵液的pH值影响大，应采用少量多次的流加方法，以免造成pH值过高，或pH值过低，NH4+不足等现象。应根据微生物的特性、发酵过程的菌体生长情况、耗糖情况等控制在pH值7.08.0，最好是采用自动控制连续流加方法.以尿素作为氮源进行流加调节pH值。尿素分解放出氨，使pH上升；同时氨和培养基中的营养成分被微生物利用后形成有机酸等中间代谢产物，使pH值降低，这时候就需要及时流加尿素，以调节pH值和补充氮源。反复进行流加就可维持一定的pH值。,第三节溶解氧对发酵影响和控制,氧对发酵的影响及控制,提高溶解氧措施,影响氧溶解传递因素,微生物对氧的需求,发酵生产中，通入发酵罐空气的氧吸收效率通常情况下常常低于1。改进通气效率，提高溶氧水平，是提高好氧发酵生产效率关键。,一）、M对氧的需求,1工业发酵M多为需氧菌，必须利用分子态氧作为ETC末端的电子受体以释放大量能量。在好氧深层培养中，氧供应往往是发酵能否成功的重要限制因素之一。2微生物对氧的消耗程度：1）呼吸强度：菌体的绝对需氧量，即单位时间内，单位重量干细胞所消耗氧的量，通常以Qo2表示。单位为molO2（kg干细胞s）。2）耗氧速率：或称为摄氧率，即单位体积培养液在单位时间内的耗氧量。取决于M的呼吸强度和单位体积的菌体浓度.,3菌体生长过程中呼吸强度的变化,不同M或同一M的不同阶段，呼吸强度不完全相同。各种M的呼吸强度在达到临界溶氧前随培养液中溶解氧浓度的增加而增加，超过临界值，则与溶氧浓度无关。一般在发酵过程中，使发酵液中的氧浓度维持在该M临界氧浓度即可。M在发酵周期内对氧的需求随发酵情况有所变化。菌丝浓度大，需氧量就高，生产上常用菌丝浓度来估计培养过程中的需氧量作为供氧的参考数据。接种量大，生长快，菌丝浓度就高，需氧就多。接种菌龄适宜，菌丝生长较快，可缩短滞留期，从而加快了对氧的需要。,二）、影响氧溶解和耗氧的因素,1影响溶氧的因素微生物只能利用溶解氧。氧是难溶于水的气体。在培养基中由于含有大量的有机物和无机物，氧的溶解度更低（约为0.21mmolO2/L）。如果外界不能及时供给氧，这些溶解氧仅能维持微生物菌体1520s的正常呼吸。在发酵工业中，随着高产菌株的获得、高浓度发酵及丰富培养基的采用，对氧气的供应要求更高。2影响耗氧的因素培养基的成分和浓度影响菌龄影响耗氧发酵条件影响耗氧。排出有毒产物对耗氧有利。,影响氧溶解和耗氧的因素（续）,3、溶氧对发酵的影响1）临界氧浓度（C临界）：满足M呼吸的最低氧浓度。一般M临界氧浓度很低为：0.003-0.05mM，为饱和氧浓度的1-25%，体积需氧量为25100mM/LhA、在临界氧浓度以下，M的呼吸强度随溶氧浓度降低而显著下降。B、当氧为限制性基质时，溶解氧浓度高于临界值，细胞的比耗氧速率保持恒定，若低于临界值，则比耗氧速率就会显著下降，细胞处于半厌氧状态，细胞代谢受阻。2）溶氧大小对菌体生长和产物合成及产量都有影响。3）发酵产物和细胞生长的最适氧浓度和菌体的代谢途径和细胞特性有关，它对细胞代谢循环有很大影响，尤其在氨基酸和抗生素代谢生产中。,影响供养的因素,一影响Kla的因素1搅拌:注意加设挡板,提高通气效率.2空气流量:不要让气流流量超过过载速度,注意空气流量和Kla的关系.3培养液的影响:注意液体的流体性质.黏度对溶氧的影响很大.4微生物生长的影响:细胞浓度增大会使Kla减小.5消跑沫的影响:6离子强度的影响:形成的气泡和Kla一般都比水中的大.,三）、溶氧浓度的控制方法,发酵液的溶氧浓度主要是由供养和需氧决定，而供养主要考虑氧传递的推动力和体积溶氧系数Kla值；需氧量则主要和菌体浓度有关，可通过控制菌的比生长速率比临界值略高的水平使溶氧达到最适浓度。具体操作步骤：1、改变通气速率主要是通过改变KLa来改变供氧能力。有两种情况：在低通气量的情况下，增大通气量对提高溶氧浓度有十分显著的效果；在空气流速已经十分大的情况下，再增加通气速率，作用不明显，反而会产生某些副作用，比如泡沫的形成、水分蒸发、罐温增加以及染菌几率增加等。,溶氧浓度的控制方法（续一）,2、改变搅拌速度：一般说来，改变搅拌速度的效果要比改变通气速率大，这是因为：通气后,泡沫被充分破碎，增加有效气液接触面积；液流湍动增加，气泡周围液膜厚度和菌丝表面液膜厚度减小，并延长了气泡在液体中的停留时间，因而就较明显地增加KLa，提高了供氧能力。3、改变气体组成中的氧分压：用通入纯氧方法来改变空气中氧的含量，提高了KLa值，因而提高了供氧能力。纯氧成本较高，但对于某些发酵，如溶氧低于临界值时，短时间内加入纯氧是有效而可行的，这种方法在实验室动植物细胞培养中已被采用。其他富氧装置也在开发，但因成本核算问题，离实际规模化应用还有距离。,溶氧浓度的控制方法（续二）,4、改变罐压：实际上就是改变氧的分压PO2来提高液相氧浓度，从而提高供氧能力，但此法不是十分有效5、改变发酵液的理化性质：在发酵过程中，菌体本身的繁殖及代谢可引起发酵液性质不断改变，会影响培养液中气泡的大小、气泡的溶解性、液体的流动及界面或液膜的阻力，显著地影响到溶氧，应根据具体情况改造培养液的物理性质.,溶氧浓度的控制方法（续三）,6、加入传氧中间介质：传氧中间介质一般是不溶于培养液的液体，呈乳化状态来提高气液相之间的传递，也就是说在气液之间起到了氧传递的促进作用。传氧中间介质常用的有：血红蛋白、烃类碳氢化合物（煤油、石蜡、甲苯与水等）、含氟碳化物。,第四节、二氧化碳对发酵的影响及控制,一、CO2对发酵的影响1、生长抑制作用：通常CO2对菌体生长具有抑制作用，当排气中CO2浓度高于4时，微生物的糖代谢和呼吸速率下降。注意CO2效应。2、发酵抑制作用：CO2对某些发酵还能产生抑制作用。如某些氨基酸（异亮氨酸、组氨酸）、抗生素（紫苏霉素、红霉素、四环素）等的发酵，特别是抗生素发酵中3、影响酸碱平衡：CO2影响酸碱平衡,使发酵液的pH值下降4、参与化学反应：CO2可与某些化学物质发生化学反应。如与生长必需金属离子形成碳酸盐沉淀，间接影响菌体生长和产物合成,CO2浓度的控制,CO2在发酵液中的浓度变化受到许多因素影响，如细胞的呼吸强度、发酵液的流变学特性、通气搅拌程度；罐压大小、设备规模等。对CO2浓度的控制主要看其对发酵的影响，如果对发酵有促进作用，应该提高其浓度；反之对发酵有抑制作用，则应设法降低其浓度。1、提高通气量和搅拌速率：提高通气量和搅拌速率，在调节溶解氧的同时，还可以降低CO2的浓度。即使溶解氧保持在临界值以上，CO2又可随着废气排出，使其维持在引起抑制作用的浓度之下2、降低通气量和搅拌速率：降低通气量和搅拌速率，有利于提高CO2在发酵液中的浓度。,CO2浓度的控制,3、补料控制：CO2的产生与补料控制有密切关系。例如，在青霉素发酵中，补糖可增加CO2在排气中的浓度，使培养液的pH降低。补糖、CO2浓度和pH之间有相关性，CO2的变化是青霉素补料工艺控制的重要参数，比pH的变化更为敏感。4、呼吸商和发酵的关系：呼吸熵：指菌体释放二氧化碳的速率与菌体摄氧速率的比值。,第五节、泡沫对发酵的影响与控制,1、泡沫产生的原因1）通气和搅拌：好氧发酵过程中，需要不断通入大量的无菌空气，同时，为了加速和提高氧在培养基中的溶解度，还必须进行剧烈的搅拌，由外界引进的气流被机械分散，成为无数的小气泡，以增加气一液界面，氧传递速率增加，有利于溶氧和逸出CO2。2）微生物生长代谢微生物细胞生长代谢和呼吸也会排出气体，如氨气、二氧化碳等，这些气体聚结成发酵性泡沫。,泡沫产生的原因（续一）,3）培养基的成分：发酵液中含有的蛋白质、糖和脂肪等在通气发酵过程中会促进一定量泡沫的产生。蛋白质原料是主要的发泡物质和跑沫稳定剂（在同一浓度下，起泡能力最强的是玉米浆，其次是花生饼粉，再其次是黄豆饼粉）。糖类物质本身起泡能力很差，但在丰富培养基中，较高浓度的糖类物质增加培养基的黏度，而有利于泡沫的稳定（例如，葡萄糖在黄豆饼粉溶液中的浓度越高，起泡能力也越强）。发酵液的粘度越大，越容易起泡，泡沫多且持久稳定。,泡沫产生的原因（续二）,4）培养基的灭菌方法：也会改变培养基的性质，从而影响培养基的起泡能力。例如，随着糖蜜培养基灭菌温度从110上升至130，灭菌时间为0.5h，发泡系数几乎增加一倍。这可能是因为形成大量的蛋白黑色素和5羟甲基糖醛的缘故。5）培养液的温度、酸碱度、浓度等对发酵过程的泡沫形成也有一定的影响。6）注意跑沫的消长规律：泡沫随着通气量和搅拌速度的增加而增大，并且搅拌引起的泡沫比通气量要大，可通过减少通气量和搅拌速度预防泡沫,泡沫的类型、稳定性及对发酵危害,1）、泡沫的类型：根据发酵液性质的不同，存在有两种类型泡沫。一类是存在于发酵液的液面上，气相比例特别大。在稀薄的前期发酵液或种子培养液中最常见。另一类是存在于较稠的菌丝发酵液中，这种泡沫均匀而细，比较稳定，又称为流态型泡沫。2）、泡沫的稳定性1）液体的表面性质：表面张力、表观黏度、泡沫的机械强度,培养基理化性质对泡沫形成及稳定性起了决定性作用,3泡沫对发酵的危害,逃液：培养液随泡沫的渗出，造成大量产物的损失；装填系数减少：染菌：泡沫“顶罐”有可能使培养基从搅拌的轴封渗出，增加染菌机会；环境发生改变：由于泡沫的液位变动，以及微生物随泡沫漂浮或粘附在罐盖或罐壁上使微生物生长的环境发生改变。妨碍微生物的呼吸：自溶：泡沫直接或间接导致M提早自溶，又会促使更多的泡沫生成；提取困难：为了将泡沫控制在一定范围内，就需加入消泡剂，将会对发酵工艺和产物提取带来困难。,、泡沫的防止和消除,1）、减少起泡物质和外力。2）、化学消泡3）、机械消泡：A、优点是不需在发酵液中加入其他物质，减少了由于加入消泡剂所引起的染菌机会和对后继分离工艺的影响；缺点是消泡的效果不如化学消泡迅速、可靠，不能从根本上消除引起泡沫稳定的因素。对黏度较大的流态型泡沫几乎没有作用。同时它还需要一定的设备和消耗一定的动力，是辅助方法。,机械消泡的方法,罐内消泡：耙式消泡桨机械消泡：耙式消泡桨是结构比较简单的罐内机械消泡装置，常用的耙式消泡桨装在发酵罐的搅拌轴上，安