微生物工程第二章-培养基及其制备VIP

第二章：培养基及其制备,培养基：广义上讲培养基是指一切可供微生物细胞生长繁殖所需的一组营养物质和原料。同时培养基也为微生物培养提供除营养外的其它所必须的条件。,发酵培养基的作用：,满足菌体的生长促进产物的形成,发酵培养基的要求,培养基能够满足产物最经济的合成。发酵后所形成的副产物尽可能的少。培养基的原料应因地制宜，价格低廉；且性能稳定，资源丰富，便于采购运输，适合大规模储藏，能保证生产上的供应。所选用的培养基应能满足总体工艺的要求，如不应该影响通气、提取、纯化及废物处理等。,第一节培养基的类型及功能,一、培养基按其组成物质的纯度、状态、用途可分为三大类型,1、按纯度,合成培养基:原料其化学成分明确、稳定,适合于研究菌种基本代谢和过程的物质变化规律,培养基营养单一，价格较高，不适合用于大规模工业生产,天然培养基:采用天然原料,原料来源丰富(大多为农副产品)、价格低廉、适于工业化生产,原料质量等方面不加控制会影响生产稳定性,M培养基(1L)：Na2HPO46g，KH2PO43g，NaCl0.5g，NH4Cl1g，MgSO4.7H2O0.5g，CaCl20.011g，葡萄糖2-10,pH7.0,YPS培养基：酪蛋白胨（日本大五营养）10g，酵母提取物（英国Oxoid）5g,NaCl10g，PH7.2,培养大肠杆菌常用两种培养基,2、按状态,固体培养基:适合于菌种和孢子的培养和保存，也广泛应用于有子实体的真菌类，如香菇、白木耳等的生产,半固体培养基:即在配好的液体培养基中加入少量的琼脂，一般用量为0.5%0.8%,主要用于微生物的鉴定。,液体培养基:80%90%是水，其中配有可溶性的或不溶性的营养成分，是发酵工业大规模使用的培养基。,3、按用途（从发酵生产应用考虑）培养基按其用途可分为孢子（斜面）培养基、种子培养基和发酵培养基三种,二、发酵培养基的选择1、选择培养基的基本原则必需提供合成微生物细胞和发酵产物的基本成分。有利于减少培养原料的单耗，提高单位营养物质所合成产物的数量或最大产率。有利于提高培养基和产物浓度，以提高单位容积发酵罐的生产能力。有利于提高产物的合成速度，缩短发酵周期。尽量减少副产物的形成，便于产物的分离纯化。原料价格低廉，质量稳定，取材容易。所利于提高氧的利用率，降低能耗。有利于产品的分离纯化，并尽可能减少产生“三废”物质。用原料尽可能减少对发酵过程中通气搅拌的影响，,三、原料转换及意义1、方法（1）碳源的节约和代用使用稀薄培养基，适当降低碳氮比，严格控制放罐时残糖浓度；改用废糖蜜、废葡萄糖母液和工业用葡萄糖来代替淀粉、糊精和食用葡萄糖等；改革工艺，改进代谢控制方法；提高生产菌种的发酵单位。开拓新的原料资源和微生物资源，主要是野生植物纤维、木屑水解物、石蜡、醋酸、乙醇等代粮发酵资源。（2）进展：乙醇、醋酸代粮发酵（作业：同学们自己查找相关资料）2、意义,2、选择培养基的方法了解生产菌种的来源、生活习惯、生理生化特性和一般的营养要求；了解生产菌种的培养条件、产物形成、一般提炼方法、产品质量要求等。摇瓶试验和小型发酵罐培养，摸索有机碳源和氮源的利用情况和产生代谢产物的能力。确立一个培养基配比，再做各种重要的金属和非金属离子的影响试验。复合培养。试验各种发酵条件和培养基的关系中间补料方法的研究：调节碳氮；添加中间体,第二节淀粉水解糖的制备,一、糖是最主要的碳源,作用,提供微生物菌种的生长繁殖所需的能源和合成菌体所必需的碳成分,提供合成目的产物所必须的碳成分,来源,糖类、油脂、有机酸、正烷烃,所有的微生物都能利用葡萄糖但是会引起葡萄糖效应,工业上常用淀粉水解糖,但是糖液必须达到一定的质量指标,（一）、有关的概念糖化：在工业生产上将淀粉水解为葡萄糖的过程称为淀粉的糖化。淀粉糖：由淀粉制得的水解糖液，其主要成分是葡萄糖、少量麦芽糖和其他二糖、低聚糖、复合糖类、原料带来的杂质（如蛋白质、脂肪等）及其分解产物。易被利用的淀粉水解产物：葡萄糖、麦芽糖及蛋白质、脂肪分解产物即氨基酸、脂肪酸等是微生物生长的营养物不能被利用的淀粉水解产物：一些低聚糖类及复合糖类等杂质。,（二）、淀粉水解糖的制备方法1、酸解法（酸糖化法）（1）原理：它是以酸（无机酸或有机酸）为催化剂，在高温高压下将淀粉水解转化为葡萄糖的方法。（2）优点：生产简易，由淀粉逐步水解为葡萄糖的整个化学反应过程，仅仅在一个高压容器里进行，对设备要求简单；水解时间短（如采用10Be浓度淀粉，在0.294MPa（表压）压力下需20min左右；在0.343MPa（表压）下仅需710min即可将淀粉转化为葡萄糖）；设备生产能力大。,（3）缺点由于水解作用是在高温、高压及一定酸浓度条件下进行的，因此，酸解法要求有耐腐蚀、耐高温、高压的设备；淀粉在酸水解过程中所发生的化学变化是很复杂的，除了淀粉的水解反应外，尚有副反应的发生，这将造成葡萄糖损失而使淀粉转化率降低；对淀粉原料要求严格，淀粉颗粒不宜过大，大小要均匀，颗粒大，易造成水解不透彻；淀粉乳浓度也不宜过高，浓度高，淀粉转化率低。,2、酶解法（1）原理：用淀粉酶将淀粉水解为葡萄糖。“液化”和“糖化”都是在微生物酶的作用下进行的，故也称为双酶水解法。（2）步骤：液化：利用-淀粉酶将淀粉转化为糊精及低聚糖，使淀粉的可溶性增加；糖化：利用糖化酶将糊精或低聚糖进一步水解，转变为葡萄糖的过程。,（3）优点：条件较温和，因此不需耐高温、高压、耐酸的设备，便于就地取材，容易上马。专一性强，副反应少，因而水解糖液纯度高，淀粉的转化率（出糖率）高。可在较高淀粉乳浓度下水解。酸解法一般作用1012Be（含淀粉18-20）；酶解法用2023Be（含淀粉3440），而且可采用粗原料。由于微生物酶制剂中菌体细胞的自溶，糖液的营养物质较丰富，这就使发酵培养基的组成可加以简化。用酶法制得的糖液颜色浅、较纯净、无苦味、质量高，有利于糖液的精制。,（4）缺点：反应时间较长（从投料到糖化完毕需23天），要求的设备较多；需要具备有专门培养酶的条件；由于酶本身是蛋白质，易造成糖液过滤困难。3、酸酶结合法（1）酸酶法原理：事先将淀粉酸水解成糊精或低聚糖，然后再用糖化酶将其水解为葡萄糖的工艺。适用范围：颗粒较紧密的原料（如谷物淀粉）。优点：酸液化速度快，且糖化是由酶来进行的，对液化液要求不高，可采用较高的淀粉乳浓度，提高生产效率。,（2）酶酸法原理：将淀粉乳先用-淀粉酶液化到一定程度，然后用酸水解成葡萄糖的工艺。适用范围：颗粒大小不一（如碎米淀粉等）的原料。优点：能采用粗原料淀粉，淀粉浓度较酸法高，生产较易控制，时间短，而且酸水解pH稍高，可减少淀粉水解副反应的发生，糖液色泽较浅。酶法制葡萄糖，采用较高淀粉浓度，提高设备生产能力，节省酸、碱的消耗。,不同的制糖工艺生产的糖液质量差别很大,（三）、淀粉酸水解理论基础在淀粉糖化过程中，同时发生三种反应：淀粉水解反应：淀粉经水解反应生成葡萄糖；复合反应：是葡萄糖分子经1，6键结合成龙胆二糖、异麦芽糖和其他低聚糖。分解反应：是葡萄糖分解为羟甲基糠醛、有机酸和有色物质等非糖产物。三种反应的关系：淀粉的水解反应：主要反应；葡萄糖的复合和分解反应：次要反应；,1、淀粉的水解反应直链淀粉：聚合度6000以下支链淀粉：支叉分子，支叉位置为-1,6糖甙键，聚合度一般都在6000以上。淀粉水解的概念：淀粉的颗粒结构破坏，-1,4糖甙键及-1,6糖甙键被切断，这种作用是在酸的催化进行的。反应机理HH2OH3O（阳离子）H3O糖甙键氧原子不稳定化合物（共轭酸）（）C1O键断裂C1正碳离子（）水分子C1结合，再使C1失去H+，完成糖甙键的水解过程。,淀粉水解的过程：淀粉糊精低聚糖麦芽糖葡萄糖糊精及其性质糊精：若干种分子大于低聚糖的碳水化合物总称。性质：有旋光性、还原性，能溶于水，不溶于酒清。呈色反应：一般聚合度（葡萄糖单位）3035时，呈蓝色；随着聚合度的降低，呈暗紫紫红褐暗红红浅红。糖化液的还原性：淀粉水解生成的葡萄糖、麦芽糖及低聚糖等具有还原性基团。,淀粉酸解反应动力学淀粉水解反应速度取决于三种物质的浓度淀粉水解反应属于单分子反应的一级化学反应类型一级化学反应的反应速度与反应物质的浓度成正比例关系,2、葡萄糖的复合反应复合反应在淀粉的酸糖化过程中，葡萄糖受酸和热的催化，通过糖甙键相聚合，失掉水分子，生成二糖、三糖和其他较高的低聚糖等。复合反应的特点复合反应是可逆的。复合反应进行的程度及所生成复合糖的种类因反应条件（如糖浓度、酸种类、酸浓度、温度等）而不同。,第三节糖蜜的前处理,糖蜜是制糖生产时的结晶母液，它是制糖工业的副产物。,糖蜜主要含有蔗糖，总糖可达50%75%。一般糖蜜分甘蔗糖蜜和甜菜糖蜜葡萄糖蜜。,不用加工方法对甘蔗糖蜜的影响,糖蜜的分级：,甘蔗糖蜜为棕黄色至黑褐色的均匀浓稠液体，要求无夹杂物，无异臭味，无发酵迹象，因所含糖分与微生物的数量不同而分为三级，但各地区的具体要求也略有差异，例如四川内江糖厂的糖蜜按下列要求分三级：一级糖蜜：含糖分为5865；含微生物1.09.0万个1克；二级糖蜜：含糖分为5258；含微生物1550万个1克；三级糖蜜：含糖分为4652；含微生物100800万个1克。广东顺德糖厂的糖蜜按下列要求分三级：一级糖蜜：含糖分为50以上；二级糖蜜：含糖分为4850；三级糖蜜：含糖分为48以下。,甜菜糖蜜的成分,项目辽宁黑龙江锤度（Bx）81.6079.6全糖分%48.7649.4蔗糖%48.7649.27转化糖%/0.13纯度%59.7662.0PH7.47.4胶体%10.0010.00硫酸灰分%7.3310.00总氮量%2.082.16磷酸（P2O5）%0.0290.035,糖蜜酒精发酵的特点,干物质浓度很大糖分高产酸细菌多灰分与胶体物质很多如果不预先进行处理，酵母是无法直接进行发酵的。因此必须进行预处理。,糖密的处理程序,稀释酸化、灭菌、澄清、添加营养盐,糖蜜的稀释,(1)单浓度流程稀糖液浓度2225(2)双浓度流程酒母稀糖液1214；基本稀糖液3335(二)糖蜜的稀释方法糖蜜的稀释方法可分为间歇与连续两种：1间歇稀释法糖蜜的间歇稀释是在稀释罐内进行；稀释罐内附有搅拌器。如果工厂原有糖化锅设备，一般都利用糖化锅作稀释设备。糖蜜间歇稀释法是先将糖蜜由泵送入高位槽，经过磅秤称重后流入稀释罐，同时加入一定量的水，开动搅拌器充分拌匀，即得所需浓度的稀糖液，经过滤后可供酒母培养和发酵用。,2连续稀释法目前我国糖蜜酒精工厂多采用连续稀释法，糖蜜连续稀释是通过连续稀释器进行，常用的连续稀释器有下列两种型式：,图21为不带搅拌器的糖蜜连续稀释器该稀释器为一只圆筒形的管子，顺着管长装有若干孔板式的隔板和一块筛板，为了使糖蜜与水更好地混合，各板上的孔位都是交错配置，即一个孔在上部，一个孔在下部，这样使液体在流动过程中，呈湍流式运动，隔板上孔的直径，是根据保证液体在器内的湍流式流动来计算的。隔板固定在一对水平轴上，能与轴一道拆卸，以便清洗。稀释器安装时通常出口的一端向下倾斜，这种稀释器的混合效果较好，同时也节省动力。,(1)不带搅拌器的连续稀释器,（2）立式连续稀释器,该稀释器也是一只圆筒形的管子，它是利用截面积不断的改变，保证液体在器内的湍流式流动来达到糖蜜与水均匀混合的目的。糖蜜连续稀释时，首先用泵将糖蜜送至高位槽，然后借位压流往稀释器，与来自另一高位槽的热水混合。保证稀糖液的一定浓度是连续稀释器操作的关键，调节稀糖浓度是依靠相应的阀门用人工控制，在大型工厂中采用能调节水及糖蜜流量的联动泵来控制。,(三)稀释时糖蜜加水量的计算糖蜜稀释时，控制稀糖液的浓度是一关键的环节，为了制备一定浓度的稀糖液及精确计算所需的加水量和糖蜜量，通常可以采用下列公式来计算：PcVdc1式中p糖蜜量(公斤)c糖蜜浓度(Bx)V稀释后糖液的体积(公斤)d稀糖液的比重c1稀糖液的浓度(Bx),所需的糖蜜量；PVdC1/C稀释律时所需添加水的量为w，则WYdp又VdpC/C1W=PC/C1PWP（CC1）/C1返回,糖蜜的酸化、灭菌、澄清和添加营养盐,目前我国糖蜜酒精工厂多采用连续稀释热酸法澄清处理糖蜜，把酸化、灭菌、添加营养盐和澄清同时一道进行。1糖蜜的酸化糖蜜加酸酸化的目的是防止杂菌的繁殖，加速糖蜜中灰分与胶体物质沉淀，同时调整稀糖液的酸度，使适于酵母的生长。由于甘蔗糖蜜为微酸性，甜菜糖蜜为微碱性，而酵母发酵最适pH4.04.5，所以工艺上要求糖蜜稀释时要加酸。对甜菜糖蜜来说，加酸可以使其中的Ca+生成硫酸钙沉淀，因而加速糖蜜中胶体物质与灰分一道沉淀而除去。,通常间歇发酵时，较普遍的是采用将酸加入稀糖液中的方法。也有将酸直接加入糖蜜中，但此法在我国很少采用。现在我国糖蜜酒精工厂多采用将糖蜜稀释到4060时，再加酸，然后加热澄清，取清液再进行稀释。这样既能提高酸的灭菌作用，又可加速沉淀，并能减少酸化设备的容积，提高设备利用率。优点：糖蜜只须经一次稀释，简化了生产过程，有利于实行自动化；加酸可在室外进行，以降低厂房的高度；无须设置单独的输酸管道。缺点：由于糖蜜黏度大，为了保证糖蜜和酸均匀混合，必须有专门的混合器；酸化后贮存时贮槽的槽壁必须用涂沥清漆或铺聚氯乙烯板等耐酸材料。糖蜜酸化时，通常用硫酸来酸化，也可用盐酸，但用盐酸时，在以后生产过程中不生成沉淀，而硫酸盐是生产设备积垢的主要原因之一。用盐酸酸化后回收酵母的色泽较好，因Cl-离子能起一定的漂白作用，但盐酸的腐蚀性较大，在缺乏耐酸材料的情况下，用盐酸有一定的困难。,甘蔗糖蜜稀释时可直接加入稀糖液量0.20.3的浓硫酸，混合均匀即可，用酸量(比重1.86，66Be工业硫酸)23.5公升1吨糖蜜；或者0.7l公升1m3发酵醪。甜菜糖蜜大多带有碱性，故用酸量较甘蔗糖蜜为多，对单浓度流程来说，基本稀糖液一般不加酸，而酒母稀糖液酸度应在67。甜菜糖蜜中的有机碱(-NH2)，在加酸时与酸作用能放出剧毒的黄棕色气体NO2，为了避免中毒，酸化槽必须要有排气孔，酸化工段应有良好的通风设备。,2糖蜜的灭菌糖蜜中常污染大量的微生物，大致包括野生酵母，白念球菌以及乳酸菌一类的产酸菌。为了防止糖液染菌，保证发酵的正常进行，除了加酸提高糖液的酸度外，最好还要进行灭菌，灭菌方法有两种：(1)加热灭菌(2)药物防腐前往,加热灭菌,通蒸汽加热到8090，维持1小时，即可达到灭菌的目的。稀糖液的加热除了灭菌外，还有利于澄清作用，但加热处理需要耗大量的蒸汽，又需要增设冷却、澄清设备，一般工厂不宜采用。返回,药物防腐,我国糖蜜酒精工厂常用防腐剂为：漂白粉，用量为每吨糖蜜200500克；甲醛，用量为每吨糖蜜用40%甲醛600毫升；氟化钠，用量为醪量的0.01；五氯代苯酚钠，用量为0.004。五氯代苯酚钠的结构式使用时应注意它在酸性环境中分解成五氯苯酚和钠盐，所以应添加在未酸化的糖蜜稀释液中。,我国吉林新中国糖厂酒精车间曾用多种药物对严重染菌糖蜜进行了灭菌试验，分别加入含量为92的五氯代苯酚钠0.0004，含量为40的甲醛0.084，漂白粉0.006。试验结果表明：五氯代苯酚钠的效果最好，漂白粉次之，甲醛更次之。,近几年，抗菌物质也有用于防止发酵时杂菌的污染。苏联一些酒精工厂采用一种名叫抗乳菌素的抗菌物质，它是从紫色放线菌1351的菌丝体中分离出来，当发酵液中添加l20微克毫升(溶解于50酒精溶液)时，便可抑制乳酸菌活动，而不影响霉菌与酵母的生长。糖蜜发酵时加入剂量为0.005的抗乳菌素，不影响酒精的产量和质量，而抑制乳酸菌的效果甚好。返回,3糖蜜澄清,糖蜜中含有很多的胶体物质、灰分和其它悬浮物质，它的存在对酵母的生长与酒精发酵均有害，故应当尽可能除去，糖蜜的澄清方法有：(1)加酸通风沉淀法（冷酸通风处理法）(2)热酸处理法(3)机械分离法前往,加酸通风沉淀法（冷酸通风处理法）,将糖蜜加水稀释至50Bx左右加入0.20.3浓硫酸通入压缩空气1小时静止澄清8小时取出上清液作为制备糖液用通风一方面可赶走SO2或NO2等有害气体以及挥发性酸和其他挥发物质；另一方面可增加糖液中的含氧量，提高糖液的溶氧系数，以利酵母的增殖。返回,热酸处理法,在较高的温度和酸度下，对糖蜜中有害微生物的灭菌作用和胶体物质、灰分杂质的澄清沉降作用均较强。采用热酸处理法，通常把酸化灭菌和澄清同时进行，工艺上在原糖蜜稀释时，采用阶段稀释法。第一阶段先用60温水将糖蜜稀释至5558Bx，同时添加浓硫酸调整酸度，PH33.8，进行酸化，然后静止5-6小时。第二阶段则将已经酸化的糖液再稀释到酵母培养液所需的浓度1214，而供发酵醪用的糖蜜经连续稀释器一次加水稀释至所需要的浓度。然后流入主发酵罐内。,实例糖蜜加水稀释到浓度为40加入一定量的硫酸，将pH调节到4-4.5放入澄清槽加热至8090，通风30分钟通风后保温7080静止澄清812小时然后取出上层清液冷却，以后处理按一般的工艺流程进行。所得沉淀物质可再加45倍的水充分搅拌然后静止澄清45小时，所得的澄清液可用作下一次稀释糖密用水，残渣则弃去。从提纯效果来看，这个方法比冷酸通风处理法好。但这个方法的缺点是：澄清时间较长，需要较多澄清桶，占地面积大，花劳动力多。从减少设备腐蚀，不需冷却设备，缩短生产周期，大规模生产采用冷酸通风沉淀方法较适宜。,国内有些工厂试验添加聚丙烯酰胺(PAM)絮凝剂来作酒母稀糖液的澄清处理，可大大缩短澄清时间。聚丙烯酰胺是由约4万个丙酰胺单体CH2CH-CONH2组成的，它的化学结构式为：添加絮凝剂加速澄清沉降的工艺操作如下：先将糖蜜加水稀释4050Bx，加一定硫酸调pH33.8，加热100，添加8PPm的PAM，搅拌均匀，絮凝澄清静止1小时，取清液即可制备稀糖液用。国内大多数糖蜜酒精工厂只考虑用作酒母的稀糖液进行澄清处理，而对基本糖液则不经澄清处理，这样可大大简化生产，提高效率。返回,(3)机械分离法,采用压滤法或离心机分离法。返回,4营养盐的添加,酵母生长繁殖时需要一定的氮源、磷源、生长素、镁盐等。新鲜甘蔗汁或甜菜汁原含有足够酵母所需要的含氮化合物、磷酸盐类及生长素，但由于经过了制糖和糖蜜的处理等工序而大部分消失。糖蜜因制糖方法的不同，所含的成分也不一样，稀糖液中常常缺乏酵母营养物质，不但直接影响酵母的生长，而且影响酒精的产量。因此必须对糖蜜进行分析，检查是否缺乏营养分，了解缺乏的程度，然后适当添加必须的营养分。,(1)甘蔗糖蜜所需添加的营养分和生长素甘蔗糖蜜对酵母来说需要添加氮源、磷源、镁盐和生长素。氮源氮的需要量可根据酵母细胞数及糖蜜中氮的含量来计算。例如每一毫升成熟酒母醪含有1.5亿酵母细胞，即一公升中含有1500亿，每1亿酵母重0.07克，则每公斤酒母中酵母细胞的重量为15000.0710.5克。已知鲜酵母含氮量为2.1，则每公斤酒母醪含氮量为100.0210.21克，而制备一公斤酒母醪用糖蜜150克。,甘蔗糖蜜含氮约0.5，其中能被酵母利用的氨基态氮及其它氮素仅为2025，即150克糖蜜中含有能被利用的氮0.15克，甘蔗糖蜜中的氮不能满足酵母生长繁殖的需要，故甘蔗糖蜜需添加氮源。,我国甘蔗糖蜜酒精工厂普遍采用硫酸铵(NH4)2SO4作为N源，因为铵易被酵母消化，用量为每吨糖蜜添加氮量为21的硫酸铵11.2公斤，即0.10.12。四川内江一带多采用每公升糖蜜添加1克硫酸铵。有些工厂添加尿素，尿素含氮量为46，因而可适当减少用量，通常为硫酸铵用量的一半。,有些工厂加酵母自溶物作为稀糖液的氮素补充物。取分离出的酒精酵母泥，置于3540温度下，使酵母细胞自溶，通过菌体的蛋白酶将酵母细胞分解为氨基酸作为氮源的补充，这样可减少34的硫酸铵用量。有些工厂添加麸曲作为氮源的补充。麸皮中含有丰富的蛋白质，但不能直接为酵母利用，如用蛋白质分解能力强的曲霉菌制成麸曲，再加热50，保温6小时，便可使蛋白质分解变为可溶性氮，同时曲霉菌还能合成酵母所需要的生长素，故添加麸曲除了可补充稀糖液中的氮源外，还能补充生长素，这样可大大节省硫酸铵和尿素。,磷源我国甘蔗糖蜜酒精工厂所添加的磷酸盐，多数采用钠、钾、铵、钙盐类，因溶液为酸性，适于酵母的生长繁殖和酒精发酵，普遍采用过磷酸钙，用量为糖蜜的0.250.3。,镁盐镁盐的存在不仅能促进酵母的生长、繁殖，扩大酵母生长素的效能，同时也能促进酒精发酵，因激酶的催化反应前提条件是离不开Mg+，同时酵母的生长素需有镁盐共同存在才能发挥效能。因此，酒精发酵生产中添加镁盐对提高发酵率具有现实意义。我国糖蜜酒精工厂通常添加硫酸镁，用量为糖蜜的0.040.05。氯化镁或硝酸镁单独加入稀糖液则无作用，如与硫酸铵同时使用，则有促进效能。,生长素酵母必要的生长素有维生素B1、维生素B2、与菸酸、肌醇、生物素及泛酸等，各种糖蜜中的生长素由于制糖过程中的高温蒸发或糖蜜处理时加热而被破坏，宜适当添加酵母生长素，一般是添加适量的玉米桨，米糠或副麸曲自溶物等作为酵母生长素的补充。但是，从生产实践中选育分离驯养的酵母菌种，对生长素的要求并不突出，因此大规模生产时采用添加生长素的较少。然而对于低纯度糖蜜和劣质糖蜜的酒精发酵时，对生长素的要求值得引起注意。,(3)甜菜糖蜜所需要添加的营养盐在甜菜糖蜜中往往氮源足够，只缺乏磷酸盐，根据每公升酒母醪含氮量为0.21克，而制备每一公升酒母醪用糖蜜150克，含可被利用的氮0.751.5克，为需要量的6倍。但在不通气培养酒母，以及有时糖蜜含氮量低时，可加入硫酸铵或酵母自溶液来补充氮源，一般硫酸铵(含氮21%)用量为糖蜜的0.360.40%。,目前一般甜菜糖蜜酒精工厂都用过磷酸钙来作磷源，其用量为甜菜糖蜜量的1%，浸出液浓度为56%，还有直接用磷酸来作磷源，工业磷酸含量为70%(比重1.5)，用量为0.03%(对甜菜糖蜜算)。另外，还可用磷酸氢二铵（NH4）2HPO4作为磷源，它除了含磷外，还含有20%的氮，因此可以适当减少硫酸铵的用量。,稀糖液的制备流程,糖蜜使用的注意点：,除糖份外，含有较多的杂质，其中有些是有用的，但是许多都会对发酵产生不利的影响，需要进行预处理。,例：谷氨酸发酵,有害物资：胶体成分（起泡、结晶）、钙盐（结晶）生物素（发酵控制）,预处理：澄清脱钙脱除生物素,例：柠檬酸发酵,有害物质：铁离子含量高（导致异柠檬酸的生成）,预处理：黄血盐,淀粉、糊精,使用条件：微生物必须能分泌水解淀粉、糊精的酶类,缺点：难利用、发酵液比较稠、一般2.0%时加入一定的-淀粉酶成分比较复杂，有直链淀粉和支链淀粉等等。,优点：来源广泛、价格底难利用，可以解除葡萄糖效应,例：地衣牙孢杆菌生产-淀粉酶,碳源对生长和产酶的影响,碳源细胞量-淀粉酶葡萄糖4.20蔗糖4.020糊精3.0638.2淀粉3.0940.2,李江华，无锡轻工大学学报，2004,(半纤维素酶),(1.5g麸皮),嗜碱芽胞杆菌(AC-2)中碳源对碱性纤维素酶分泌的影响,结果：各种碳源相差不大,推论：该菌种的碱性纤维素酶为组成型,苏勤，林业化学与工业，2004,氮源主要用于构成菌体细胞物质（氨基酸，蛋白质、核酸等）和含氮代谢物。常用的氮源可分为两大类：有机氮源和无机氮源。,1、无机氮源,种类：氨盐、硝酸盐和氨水,特点：微生物对它们的吸收快，所以也称之谓迅速利用的氮源。但无机氮源的迅速利用常会引起pH的变化如：(NH4)2SO42NH3+2H2SO4NaNO3+4H2NH3+2H2O+NaOH,补充：氮源,无机氮源被菌体作为氮源利用后，培养液中就留下了酸性或碱性物质，这种经微生物生理作用（代谢）后能形成酸性物质的无机氮源叫生理酸性物质，如硫酸胺，若菌体代谢后能产生碱性物质的则此种无机氮源称为生理碱性物质，如硝酸钠。正确使用生理酸碱性物质，对稳定和调节发酵过程的pH有积极作用。,所以选择合适的无机氮源有两层意义：满足菌体生长稳定和调节发酵过程中的pH,毛霉产蛋白酶的研究,陈涛，中国酿造，2004,初始pH的影响:,pH偏酸比较好，中性蛋白酶影响大,无机氮源的影响：,硫酸铵硝酸铵硝酸钠尿素,2、有机氮源,来源：工业上常用的有机氮源都是一些廉价的原料，花生饼粉、黄豆饼粉、棉子饼粉、玉米浆、玉米蛋白粉、蛋白胨、酵母粉、鱼粉、蚕蛹粉、尿素、废菌丝体和酒糟。,成分复杂：除提供氮源外，有些有机氮源还提供大量的无机盐及生长因子。,例玉米浆：可溶性蛋白、生长因子（生物素）、苯乙酸较多的乳酸硫、磷、微量元素等,有机氮源成分复杂可以从多个方面对发酵过程进行影响，而另一方面有机氮源的来源具有不稳定性。所以在有机氮源选取时和使用过程中，必须考虑原料的波动对发酵的影响,氮源使用的一些相关问题：,有机氮源和无机氮源应当混合使用,早期：容易利用易同化的氮源无机氮源中期：菌体的代谢酶系已形成、则利用蛋白质,有些产物会受氮源的诱导和阻遏,例：蛋白酶的生产,有机氮源选取时也要考虑微生物的同化能力,开发效果好、有针对性的有机氮源仍然是令人感兴趣的课题,补充：无机盐的微量元素,1、作用：各种不一样,2、来源：C、N源，以盐的形式补充,3、用量：根据具体的产品，以实验决定，P104,4、使用注意点,A.对于其它渠道有可能带入的过多的某种无机离子和微量元素在发酵过程中必须加以考虑,例：铁离子青霉素发酵中，铁离子的浓度要小于20g/ml发酵罐必须进行表面处理,B、使用时注意盐的形式（pH的变化）,例：黑曲酶NRRL-330,生产-淀粉酶，P对酶活的影响pH酶活不加4.25120分钟加K2HPO45.4530分钟加KH2PO44.6275分钟,第四节纤维素代粮发酵,1、纤维素的结构,2、纤维素的化学反应特点,3、纤维素的酶反应特点,本节请同学们查资料、自学、讨论,第五节生长因子、前体和产物促进剂,从广义上讲，凡是微生物生长不可缺少的微量的有机物质，如氨基酸、嘌呤、嘧啶、维生素等均称生长因子。,1、生长因子,如以糖质原料为碳源的谷氨酸生产菌均为生物素缺陷型，以生物素为生长因子,生长因子对发酵的调控起到重要的作用。,有机氮源是这些生长因子的重要来源，多数有机氮源含有较多的B簇维生素和微量元素及一些微生物生长不可缺少的生长因子,前体指某些化合物加入到发酵培养基中，能直接彼微生物在生物合成过程中合成到产物物分子中去，而其自身的结构并没有多大变化，但是产物的产量却因加入前体而有较大的提高。,2、前体,青霉素：分子量356,苯乙酸:分子量136,作用：前体有助于提高产量和组份P107,用量：前体的用量可以按分子量衡算，具体使用有个转化率的问题,例：6000单位/ml的青霉素G,需要多少苯乙酸青霉素6000*0.6（微克）36mg/ml苯乙酸（36*136）/356=13.8mg/ml=1.38%实际使用时的转化率在46-90%之间例某厂单耗为：0.337（kg/10亿青霉素）转化率为：0.6/(0.337*36/13.8)=68%,用法：前体使用时普遍采用流加的方法前体一般都有毒性，浓度过大对菌体的生长不利苯乙酸，一般基础料中仅仅添加0.07%前体相对价格较高，添加过多，容易引起挥发和氧化，流加也有利于提高前提的转化率,3、产物促进剂所谓产物促进剂是指那些非细胞生长所必须的营养物，又非前体，但加入后却能提高产量的添加剂。,拓展：发酵培养基的设计和优化,目前还不能完全从生化反应的基本原理来推断和计算出适合某一菌种的培养基配方，只能用生物化学、细胞生物学、微生物学等的基本理论，参照前人所使用的较适合某一类菌种的经验配方，再结合所用菌种和产品的特性，采用摇瓶、玻璃罐等小型发酵设备，按照一定的实验设计和实验方法选择出较为适合的培养基。,一、培养基成分选择的原则,菌种的同化能力,代谢的阻遏和诱导,合适的C、N比,1000.22.0,pH的要求,（一）、理论转化率与实际转化率,理论转化率是指理想状态下根据微生物的代谢途径进行物料衡算，所得出的转化率的大小。,实际转化率是指实际发酵过程中转化率的大小,如何使实际转化率接近于理论转化是发酵控制的一个目标,二、成分含量的确定,例:如在酒精生产中葡萄糖转化为酒精的理论转化率计算如下葡萄糖转化为酒精的代谢总反应衡算式为C6H12O62C2H5OH+2CO2葡萄糖转化为酒精的理论得率为2*46Y=0.57162,（二）、实验设计,培养基成分的含量最终都是通过实验获得的,合理的实验方法,多因子实验：均匀设计、正交实验设计、响应面分析等。,多因子实验,当培养基成分确定后，剩下的问题就是各成分最适的浓度，由于培养基成分很多，为减少实验次数常采用一些合理的实验设计方法。,三、培养基设计的步骤,根据前人的经验和培养基成分确定时一些必须考虑的问题，初步确定可能的培养基成分；,通过单因子实验最终确定出最为适宜的培养基成分；,类胡萝卜素高产菌Y11的培养基的优化,郭秒,食品与工业发酵，2004,类胡萝卜素的作用：色素、营养保健,原培养基:,初步确定可能的培养基成分(以碳源为例),通过单因子实验确定适宜的培养基成分(以碳源为例),考虑到成本：乙酸钠是较为合适的碳源,进一步：乙酸钠的浓度2%比较好,结果：,碳源：乙酸钠0.2%,氮源：氯化铵0.2%酵母膏0.03%,无机盐:复合无机盐0.05%,正交设计确定优化的配方,改进后培养基,原培养基,改进后培养基的发酵结果,四、摇瓶水平到反应器水平的优化配方,摇瓶、反应器培养基研究的两个层次,摇瓶培养基设计的第一步,反应器最终的优化的基础配方,例：,青霉素发酵,发酵摇瓶：玉米浆4%，乳糖10%，(NH4)SO40.8%轻质碳酸钙1%,发酵罐:葡萄糖流加控制总量10-15%，玉米浆总量4-8%补加硫酸、前体等,摇瓶发酵培养基和罐的基础培养差别很大,摇瓶优化配方：菌种筛选，反应器研究的基础,发酵罐：反应器水平,可以得出最终优化的基础配方,pH控制摇床：反应器水平上的摇瓶研究,五、培养基设计时注意的一些相关问题,原料及设备的预处理,原材料的质量,发酵特性的影响,在抗生素发酵生产中往往喜欢所谓的“稀配方”，因为它既降低成本、灭菌容易、且使氧传递容易而有利于目的产物的生物合成。如果营养成分缺乏，则可通过中间补料方法予以弥补。,灭菌,在大规模发酵中应该尽可能的采取连续灭菌的操作，而且保证灭菌条件的稳定是保证发酵稳定的前提,有时避免营养物质在加热的条件下，相互作用，可以将营养物质分开消毒。,有些物质由于挥发和对热非常敏感，就不能采用湿热的灭菌方法,Na2HPO4+CaCO3CaHPO4+Na2CO3,拓展：重组产品培养基的介绍,大肠杆菌高密度度培养：,碳源：葡萄糖、甘油,氮源：胰蛋白胨、酵母粉,无机盐：磷、镁等,蛋白胨、酵母粉(OXOID),章越，生物工程学报，2004,动物细胞培养基,基础培养基:,F12、DMEM等,血清(5-10%)：胎牛(FBS)、小牛(CS)、马(HS),水：超纯水,其它：NaHCO3（CO2）、抗生素,GONG,J.B.B.2003,促进剂提高产量的机制还不完全清楚，其原因是多方面的。有些促进剂本身是酶的诱导物；有些促进剂是表面活性剂，可改善细胞的透性，改善细胞与氧的接触从而促进酶的分泌与生产，也有人认为表面活性剂对酶的表面失活有保护作用；有些促进剂的作用是沉淀或螯合有害的重金属离子。,第六节培养基与设备灭菌,一、消毒与灭菌的区别1、消毒：用物理或化学方法杀死物料、容器、器具内外的病源微生物。一般只能杀死营养细胞而不能杀死细菌芽孢。2、灭菌：用物理或化学方法杀死或除去环境中所有微生物，包括营养细胞、细菌芽孢和孢子。二、消毒与灭菌在发酵工业中的应用1、纯种培养技术要求单一菌种生长；2、接种培养之前，要对培养基、空气系统、消泡剂、流加料、设备、管道等进行灭菌，杀灭所有杂菌。3、对生产环境进行消毒，防止杂菌和噬菌体大量繁殖。,三、灭菌方法1、干热灭菌法（1）依据：干热对微生物有氧化、蛋白质变性和电解质浓缩引起中毒等作用。氧化致死是主要根据。（2）特点：干热灭菌所需要的温度要高、时间要长（3）用途：用于要求灭菌后保持干燥的物料、器具等。（4）方法灼烧灭菌法：将金属或其他耐热材料制成的器物在火焰上灼烧，在接种操作时用这种方法。干热灭菌法：利用电热或红外线在某设备内加热到一定温度将微生物杀死。,2、湿热灭菌法（1）概念：蒸汽释放的热能使微生物细胞中的蛋白质、酶和核酸分子内部的化学键，特别是氢键受到破坏，引起不可逆的变性，使微生物死亡。（2）原理：有水分存在时，蛋白质更易受热而凝固变性。（3）优点：蒸汽来源容易，操作费用低廉，本身无毒；蒸汽具有很强的穿透力，灭菌彻底；蒸汽具有很大潜热，蒸汽冷凝放出2093kJ/kg的热量，蒸汽冷凝后的水分又有利于湿热灭菌；蒸汽输送可借助本身的压强，调节方便，技术管理容易。（4）缺点：设备费用贵；不能用于怕受潮的物料灭菌。,3、射线灭菌法（1）常用射线：紫外线、高速电子流的阴极射线、X射线和射线等进行灭菌。（2）紫外线灭菌原理：利用射线的能量破坏微生物的DNA并致死微生物。用途：紫外线的能量较低，穿透力低，只能用于表面灭菌和无菌室、培养间等空间灭菌。方法：波长260nm左右灭菌效率为最高。一般用30W紫外线灯照射30分钟。影响因素：温度高，杀菌效率高；湿度大，灯的使用寿命长；空气中悬浮杂质多，杀菌效率低。,4、化学药品灭菌法：常用于生产车间环境灭菌，接种操作前双手的灭菌。根据灭菌对象不同有浸泡、添加、擦拭、喷洒、气态熏蒸等。（1）高锰酸钾溶液：使蛋白质、氨基酸氧化，使微生物死亡，浓度为0.1%0.25%。（2）漂白粉：原理：次氯酸钠分解为次亚氯酸，后者不稳定，在水溶液中分解为新生态氧和氯，使细菌受强烈氧化作用而导致死亡，对细菌和噬菌体均有效。种类：低标准漂白粉（含30有效氯）高标准漂白粉（含70有效氯）商品次氯酸钠溶液（含15有效氯）。使用方法：配制成5溶液；极细的雾沫喷洒于场地效果较好；并非所有噬菌体对漂白粉都敏感，应轮流用药。,（3）75酒精溶液原理：使细胞脱水，引起蛋白质凝固变性。作用范围：对营养细胞、病毒、霉菌孢子均有杀灭作用，但对细胞芽孢的杀灭能力较差。用途：常用于皮肤和器具表面杀菌。（4）新洁尔灭和杜灭芬：属表面活性剂类洁净消毒剂原理：它在水溶液中以阳离子形式与菌体表面结合，引起菌体外膜损伤和蛋白质变性。作用范围：对营养细胞10分钟能杀灭，但对细菌芽孢几乎没有杀灭作用。用途于用法：一般用于器具和生产环境消毒，不能与合成洗涤剂合用，不能接触铝制品。使用浓度为0.25%。,（5）甲醛原理：甲醛是强还原剂，与蛋白质的氨基结合，使蛋白质变性，对氨基酸和蛋白质的变性有较强活性。气态甲醛灭菌：将多聚甲醛气化；以2份37甲醛溶液与1份KMnO4混合；将37甲醛溶液直接加热；液态甲醛灭菌：将37甲醛溶液喷雾，可杀灭营养细胞，杀灭芽孢需要12小时，甚至更长时间效果及影响因素用气态甲醛与甲醛水溶液所产生的甲醛蒸气的灭菌效果基本相同。在0-37，甲醛的灭菌效果差别不大，当温度上升或相对湿度在50以上，可增加灭菌效果。缺点穿透力差能刺激眼、鼻和咽喉粘膜，在使用时应注意对人体的危害。,（6）戊二醛：分子式：CHO(CH2)3CHO特点：只有在碱性条件（加入碳酸氢钠或碳酸钠）才具有杀死芽孢的能力。用途及用法：常用的浓度为2，用于器皿、仪器和工具等灭菌。广谱、高效、速效杀菌剂，使用范围正在逐渐扩大,（7）过氧乙酸：特点：强氧化剂，沸点110，温度高于沸点时具有爆炸性，温度较低时分解生成乙酸和12分子氧。用途及用法：广谱、高效、速效的化学杀菌剂，对营养细胞、细菌芽孢、真菌孢子和病毒都有杀灭作用。它的水溶液、喷雾及蒸气都有杀菌作用。使用浓度为0.02%-0.2%，亦有用1-2浓度。喷雾或蒸气灭菌浓度为0.1-0.2mg/L，相对湿度为80时，灭菌效果较好。过氧乙酸作杀菌剂的优点是：浓度低至0.01%，几分钟内可杀死营养细胞；温度低至40仍有杀菌作用；0.2%过氧乙酸对人体无害，亦无公害；使用方便；应用范围广泛。缺点：有腐蚀性；储存中易分解而失效。,（8）焦碳酸二乙酯特点：商品名为“BAYCOVIN”相对分子质量162，可溶于水和有机溶剂。用途及用法：在pH8的水溶液中，杀死细菌和真菌的浓度为0.01%-0.1%(V/V)，pH4.5或以下，杀菌能力更强，是比较理想的培养基灭菌剂。由于它在水中的溶解度小，灭菌时应均匀加到培养基中。杀菌机理：能杀灭噬菌体，切断噬菌体单链DNA，抑制噬菌体DNA和蛋白质合成，并抑制寄生细胞自溶，是杀灭噬菌体有效的化学药剂。注意事项：它有腐蚀性，勿接触皮肤。,（9）酚类苯酚：作为消毒和杀菌剂已有百年历史，但苯酚的毒性较大，易污染环境，且水溶性差，使应用受到限制酚类衍生物：如甲酚经磺化得到甲酚磺酸，水溶性有所提高，且毒性降低，使用浓度0.1%0.15%，作用1015min可杀灭大肠杆菌。（10）抗生素：抗菌谱比较专一，不能同时抑制或杀灭多种微生物，很少用作杀菌剂。,四、加热灭菌原理1、微生物的热阻：微生物对热的抵抗力称为热阻。（1）微生物对热的抵抗能力营养细胞：在60加热10min全部死亡；细菌芽孢：能耐较高的温度，在100需要几分钟甚至几小时才能被杀灭；嗜热菌的芽孢：120，39min或更长时间才能杀灭。（2）致死温度：杀死微生物的极限温度。（3）致死时间：在致死温度下，杀死全部微生物所需要的时间。在致死温度以上，温度愈高，致死时间愈短。,2、微生物的热死规律-对数残留定律（1）微生物的热死：微生物受热失活，但是物理性质不变。（2）热死规律：一定温度下，微生物热死遵循分子反应速度理论。在微生物受热失活过程中，微生物不断地被杀死，活菌数不断减少，其减少速度随活菌残留量的减少而减少。菌的死亡速率dN/d与任何瞬间残留的活菌数N成正比。,灭菌时间：取决于污染程度、灭菌程度（残留菌数）和k值。计算公式：=（2.303/k）lgN0/N已知k原有活菌数N0、灭菌后得残留菌数或灭菌污染几率N，可求得灭菌时间3、反应速度常数k：（1）是微生物耐热性的一种特征，它随微生物种类和灭菌温度而异。（2）相同温度下，k值愈小，则此微生物愈耐热。（3）同一种微生物在不同灭菌温度下，灭菌温度愈低，k值愈小