生物工程下游技术第十四章电泳分离技术1

第十四章电泳分离技术,前言,1937年，瑞典科学家Tiselius设计了世界上第一台电泳仪，建立了移界电泳法，并于1948年荣获诺贝尔奖。70年以来，电泳技术围绕制胶、电泳、染色三个技术环节，不断改进，以实现下列目标：1、提高分辨率及灵敏度。2、简化操作，缩短电泳时间。3、扩大应用范围。各类电泳技术已广泛应用于生命科学各个领域。,电泳是指带电粒子在电场的作用下，向着与其电性相反的电极移动的现象。电泳技术指利用电泳现象对混合物进行分离分析的技术。,1.电泳技术的基本原理,u:泳动度or泳动率(cm/伏秒or分)V:泳动速度:cm/秒or分E:电场强度:伏特/cm,d:泳动距离:cmt:电泳时间:秒/分U:电压:常压(100500v)高压(50010000v)仅需几分钟l:支持场的长度(有效长度),(1)泳动度u(迁移率):带电质点在单位强度电场下的泳动速度,不同分子在同一电场中可能具有不同的泳动度,(2)影响泳动率u的因素内因：1.净电荷2.质点大小3.质点形状外因：1.V(U/L)2.缓冲液的pH(pH恒定)3.离子强度I最适:0.02-0.24.电渗：液体对固体支持物的相对移动,(3)电泳类型a.载体电泳纸电泳、醋酸纤维素薄膜电泳、粉末电泳、细丝电泳、凝胶电泳。凝胶电泳包括：琼脂糖凝胶、淀粉凝胶、硅胶凝胶、聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶电泳包括：垂直板、盘状、等电聚焦、梯度、免疫电泳b.自由界面电泳支持物为溶液，很少用。,2.聚丙烯酰胺凝胶电泳,聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺(Acr)和交联剂N,N-甲叉双丙烯酰胺(Bis)在加速剂N,N,N,N-四甲基乙二胺(TEMED)和催化剂过硫酸铵(AP)或核黄素(C17H2O6N4)的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶，以此凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)。,凝胶的聚合反应：,Ammoniumpersulfate(freeradicalinitiator)过硫酸铵,Acrylamide(monomer),Bis(acrylamide)(bridge),TEMED(catalyst):四甲基乙二胺,自由基的生成者,凝胶的基本單位:丙烯酰胺,交联使聚合产生分枝:甲叉丙烯酰胺,帮助传递自由基的加速剂,Acrylamide有毒性！,CH2=CH-CO-NH2,1,2,核黄素-TEMED系统与过硫酸铵-TEMED系统,丙烯酰胺单体聚合过程：,聚合反应,交联剂造成分枝,端点自由基可再延续,freeradical,Bis,Bis,聚合反应,交錯连結,自由基形成,光聚合：核黄素为催化剂(阳光,日光)，制大孔胶。化学聚合：制小孔胶。过硫酸铵(NH4)2S2O3APS(引发剂)N,N,N,N-四甲基乙二胺，TEMED(加速剂),2.1聚丙烯酰胺凝胶电泳原理,三种物理效应样品浓缩效应分子筛效应电荷效应,三种物理效率使样品分离效果好，分辨率高,（1）样品浓缩效应：由凝胶系统的不连续性产生。凝胶孔径不连续性缓冲液离子成份的不连续性pH的不连续性,凝胶孔径不连续性单体浓度交联度大孔胶:T=3%C=2.0%小孔胶:T=7%C=2.5%,凝胶网孔大小:聚合链长度:由Acr浓度交联程度:由Acr与Bis相对比例Bis的浓度低,孔径大,可在聚合前调节单体与Bis的浓度比如:AcrBisT(%)小孔28.0g0.735g7%大孔10.0g2.5g2.5%,凝胶浓度(T)的选择与被分离物质分子量密切相关。分子量范围适用的凝胶浓度/(%)蛋白质51052-5核酸(RNA)10415201041055-10105-21062-2.6,缓冲液离子成份的不连续性大孔胶pH=6.7先行离子：Cl-存在于凝胶层中任何pH值下随后离子：Gly-存在于电极缓冲液中pI=6.0pK1=2.34pK2=9.70在pH=6.7时，只有少数解离为Gly-，多数为Gly+-。Pr分子在pH6.7时以Pr-形式存在,pH的不连续性pH大孔(浓缩)胶6.7小孔(分离)胶8.9缓冲液8.3,A为电泳前3层凝胶排列顺序，3层胶中均有快离子、慢离子B显示电泳开始后，蛋白质样品夹在快、慢离子之间被浓缩成极窄的区带。C显示蛋白质样品分离成数个区带。,电泳过程示意图,不连续系统浓缩效应示意图,连续胶与不连续胶:连续胶：胶条(胶板)的浓度、pH值、组成成份不变不连续胶:胶条(胶板)的浓度、pH值、组成成份变化,连续胶的制胶过程与点样过程,玻璃板(前,后),样本梳,间隔条,间隔条,浓缩胶,分离胶,不连续胶的制胶过程与点样过程,玻璃板(前,后),样本梳,间隔条,间隔条,电泳凝胶系统的组成：,1,电泳系統,pH,胶体浓度,缓冲液,上层(负极)缓冲液,2,样品溶液,3,浓缩胶,6.9,4,分离胶,胶体,5,下层(正极)缓冲液,不连续胶有聚焦样品的作用,变性胶与非变性胶：变性胶：胶电脉在蛋白质变性的状态下进行，主要指SDS变性条件下进行。非变性胶：电泳在蛋白质保持天然状态下进行，不加变性剂。,SDS在蛋白质表面均匀敷上一层负电：,SDS,变性蛋白质成一线状分子,原态蛋白质,並且均匀带上一层负电荷,非极性尾部,极性头部,三种不同性质蛋白质的电泳比较：,X,Y,Z,-,-,+,电泳装置,图1聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳示意图(A为正面,B为剖面)(1)样品胶pH6.7(2)浓缩胶pH6.7(3)分离胶pH8.9(4)电极缓冲液pH8.3,架膜,加盖,接导线，开机,3.醋酸纤维素薄膜电泳分离血清清蛋白,电泳仪器,实验操作：浸泡将醋酸纤维素薄膜在缓冲溶液中浸泡20min，取出识别光面和麻面。点样用镊子将薄膜置于滤纸上，吸收多余的液体，用铅笔在薄膜麻面一端2cm处画一细线，利用载玻片一侧蘸取样品，于细线处点样。电泳将薄膜麻面朝下，平悬于电泳槽支架的滤纸桥上，点样一端靠近负极；通电后先使U=80V，待10min后，使U=120V电泳40min。染色将薄膜取出后，置于氨基黑10B染色剂重染色10min。漂洗将薄膜取出后，移至漂洗液中，漂洗若干次，至无蛋白区无蓝黑色。,4.等电聚焦(IsoelectrofocusingIEForEF),原理Pr为两性电解质，不同Pr其aa的数量、种类及占比例不同，因此pI不同，pI范围窄且净电荷为零，因此依pI分离Pr。EF是在凝胶中加两性载体电解质，通直流电后，可形成从阳极到阴极逐步增加的pH梯度(连续的、稳定的、线性的pH)。,原理（续）当Pr在电场中迁移到它的PI时，由于净电荷为零，不再移动。如扩散，附近的凝胶会使其荷电，阳、阴极会重新吸引它回到pI位置。因此Pr只能在pI位置被浓缩成窄、稳定的带。称这种浓缩效应为聚焦。只要凝胶中的pH梯度范围足够窄。便可将pI相近的Pr分开，EF是电泳技术中分辨率最高的技术。,方法（EF的关键）载体两性电解质CA分辨率0.01pH固相pH梯度以具弱酸或弱碱性质的丙烯酰胺衍生物CH2CHCONHRR=COOHR=4级氨基R为弱酸or弱碱,形成缓冲体系,体系分辨率达0.001pHpH梯度范围最窄可为0.01pH/cmCAIEF是两性分子,在凝胶聚合时形成两性分子；在电场中,CA迁移到自己的pI而形成pH梯度.,5.电泳技术问题及对策,1).低离子溶液中,不同电荷的蛋白质分子间会发生相互静电作用,增加溶液离子强度可减少这种作用,但会提高电泳时的电流,使产热更多,温度升高又促进蛋白质的扩散,使区带变宽,分辨率下降.因此电泳缓冲液的离子强度必须控制适当。,0.02-0.2M的离子强度离子强度低,速度快,发热低,有电渗离子强度高,速度慢,发热大,电泳技术问题及对策,2).蛋白质分子所带净电荷主要取决于电泳缓冲液的pH值,应仔细调整和控制电泳缓冲液的pH值,使各组分分子的净电荷数差异加大.但极端pH下蛋白质会变性失活,因此一般控制在pH4.59.5之间;,电泳技术问题及对策,3).缓冲液的种类,浓度和其他电解质浓度影响蛋白质所带电荷的极性和数量,同时还影响蛋白质分子间的相互作用,因此必须根据分离溶质的不同选择合适的缓冲系统;,电泳技术问题及对策,4).表面活性剂(SDS等)强烈破坏蛋白质分子间的非共价作用,使蛋白质分子为表面溶剂分子所包围,阻止了蛋白质之间的相互作用,同时也消除了不同蛋白质固有的电荷差异;,电泳技术问题及对策,5).控制电泳介质的有效黏度,包括选择适当的凝胶孔径和添