第三章-基因工程的工具酶

3基因工程工具酶Instrumentalenzymeofgeneengineering,掌握：工具酶的特性和用途1.限制性核酸内切酶2.DNA连接酶3.DNA聚合酶4.DNA修饰酶重点：限制性核酸内切酶、DNA连接酶特性和用途难点：限制性核酸内切酶、DNA连接酶特性和用途,应用于基因工程的各种酶的总称，包括核酸序列分析、标记探针、载体构建、目的基因选取、重组的、DNA制备等程序中所需要的酶类。主要是限制性核酸内切酶和DNA连接酶，末端转移酶、单链核酸酶和反转录酶。所以把这些酶称为“基因工程工具酶”。工具酶是对野生菌株（或真核生物如酵母）进行改造、优化、而产生的生物工程产品。,3.1限制性核酸内切酶,50年代后Luria和Human(1952)Bertani和Weigle(1953)发现细菌的“限制”现象：,Phage（k）,感染,E.colik,不感染,E.coliB(E.coliB限制（k）),仍有少量(K)可在E.coliB中生存，是因E.coliB对(K)DNA进行了修饰。,E.coliB,修饰,(k)*,感染,E.coli(B)-,细菌如何对噬菌体进行限制和修饰?,3.1.1细菌的限制-修饰系统,细菌的限制修饰系统,1962年W.Arber(瑞士)发现，寄主对噬菌体的修饰是在Phage的DNA上。,1965年，Arber发现修饰与的降解有关，提出：细胞中存在位点特异性限制酶和特异性甲基化酶，即细胞中有限制修饰系统(R-MRestriction-modificationsystem)。R-M系统是细菌安内御外的积极措施。,限制修饰的酶学假说,酶切位点不被修饰,噬菌体DNA被切割,酶切位点被修饰Methylation,基因组DNA不被切割,识别双链DNA分子中的特定序列，并切割DNA双链,主要存在于原核细菌中，帮助细菌限制外来DNA的入侵,限制性核酸内切酶,1968年，Meselson和Yuan从大肠杆菌K和B中发现了I型限制性核酸内切酶1970年，Smith和Wilcox从流感嗜血杆菌中分离纯化了第一个II型限制性核酸内切酶HindII，使得DNA分子的体外精确切割成为可能。,1978年，W.Arber、H.O.Smith(美)，Nathans(美)因发现限制性内切酶及对其功能研究的突出贡献获得诺贝尔奖金。,截止到目前为止，已经分离出400余种II类酶，搞清识别位点的有300种，商品化的约有100种，而实验室常用的有20种。,3.1.2限制性核酸内切酶的分类,1.限制修饰活性2.内切酶的蛋白质结构3.限制辅助因子4.切割位点5.特异性切割6.基因克隆中,I型单一多功能的酶3种不同亚基ATP、Mg2+和S-腺苷甲硫氨酸距特异性位点1000bp不是无用,II型限制酶和修饰酶分开单一成分Mg2+特异性位点及其附近是非常有用,III型双功能酶2种亚基ATP、Mg2+和S-腺苷甲硫氨酸特异性位点3端24-26bp处是有用,3.1.3II型限制性核酸内切酶的特点,1、识别位点的特异性:每种酶都有其特定的DNA识别位点，通常是由48个核苷酸组成的特定序列（靶序列）例如：Hind5-GTPyPuAC3Mbo5-GATC3GANC,2、识别序列的对称性:靶序列通常具有双重旋转对称的结构，即双链的核苷酸顺序呈回文结构。,3、切割位点的规范性:双链DNA被酶切后，分布在两条链上的切割位点旋转对称（可形成粘性末端或平末端的DNA分子）。,4、识别序列中的碱基被甲基化修饰后会影响部分酶的切割作用效果。,3.1.4限制性内切酶的切割方式限制性核酸内切酶“分子手术刀”,“切哪里”?,磷酸二酯键,脱氧核苷酸链,磷酸二酯键,基因的剪刀限制性内切酶（简称限制酶）,怎样切？,例：大肠杆菌(E.coli)的一种限制酶能识别GAATTC序列，并在G和A之间切开。,限制酶,限制酶,几种II型限制性核酸内切酶的酶切位点,什么叫黏性末端？,被限制酶切开的DNA两条单链的切口，带有几个伸出的核苷酸，它们之间正好互补配对，这样的切口叫黏性末端。3粘性末端；5粘性末端,5,3,练一练,C,B,5、原核6、核苷酸7、磷酸二酯键8、黏性末端9、平末端,3.1.5限制性核酸内切酶的命名-1973Smith和Nathams,1、寄主菌属名的第一个字母和种名的头两个字母组成3个斜体字母的略语表示酶来源的菌种名称，如大肠杆菌Escherichiacoli表示为Eco,流感嗜血菌Haemophilusinfluenzae表示为Hin；2、用1个正体字母表示菌株的类型，比如EcoR、Hind，若酶存在于质粒上，则需大写字母表示非染色体遗传因子；3、该菌株（种）中发现的不同的酶按照顺序以罗马字母编号I,II,III等。,3.1.6同裂酶和同尾酶,同裂酶（isoschizomer）：是指来源不同的但却具有相同的识别序列，切割DNA后产生相同末端（或不同末端）的一组限制酶。KpnI5GGTACC3Asp7185GGTACC3XmaI5CCCGGG3SmaI5CCCGGG3,同序同切,同序异切,同尾酶（isocaudamer）：是指来源不同、识别序列也不同但切割后产生相同的粘性末端一类限制酶。,经同尾酶消化的DNA末端连接示意图,5XXXXGGATCCXXXXXX33XXXXCCTAGGXXXXXX5,BamHI,5XXXXGGATCCXXXXXX33XXXXCCTAGGXXXXXX5,5XXXXAGATCTXXXXXX33XXXXTCTAGAXXXXXX5,BglII,5XXXXAGATCTXXXXXX33XXXXTCTAGAXXXXXX5,3.1.7限制性内切酶识别序列出现的几率及酶切片段的估算,3.1.8影响限制性内切酶活性的因素,DNA纯度DNA的甲基化程度DNA的分子结构限制性核酸内切酶的缓冲液酶切消化反应的时间和温度反应体积和甘油浓度,一个酶单位（U）指：在理想的反应条件（适宜的缓冲液和反应温度，通常为37）下，1min内引起1mol底物发生反应的酶量。,酶单位的定义和影响酶活性的因素,Buffer(10X)2.0LWater16.5LDNA1.0LEnzyme0.5LVolume20.0L,酶切反应的基本步骤,电泳,紫外分析,371h,加反应液,CK,M,1.0kb,1.0kb,0.4kb,0.5kb,0.6kb,CK,M,T,T,酶量的确定：2-3倍才能保证完全消化；DNA识别位点的密度有关,酶切操作注意事项,选择正确的酶DNA的纯度和浓度反应体系甘油的量5%（酶保存在50甘油中，故所加酶液体积最多为酶切反应总体积的1/10）。酶保存在-200C；使用时在冰浴上操作。反应体系各成分都加完后，最后加酶。每次取酶液用新的枪头，防止交叉污染。防止任何可能引起酶蛋白变性的因素，如：气泡、去污剂,星活性（staractivity）指限制性内切酶在非标准条件下，对与识别序列相似的其它序列也进行切割反应，导致出现非特异性的DNA片段的现象。易产生星活性的内切酶用*标记。如：EcoRI*,造成星活性参数,甘油浓度12-20%，酶与DNA比例，离子强度，45%聚乙二醇(PEG)，有机溶剂，8%二甲基亚枫，二价阳离子，12%乙醇。,限制性内切酶的应用,1、重组DNA前的切割,2、构建新质粒,3、构建物理图谱,4、DNA分子杂交,5、制备DNA探针,6、亚克隆以用作序列分析,7、基因定位，DNA同源性研究。,pBR322物理图谱,4363,练习题,为了绘制长为3.0kbBamH限制性片段的限制性图谱，分别用EcoR、Hpa、EcoR+Hpa消化这一片段的三个样品，然后通过凝胶电泳分离DNA片段，溴化乙锭染色后观察DNA带型。请根据这些结果绘制一个限制性图谱，要标明EcoR和Hpa识别位点间的相对位置，以及它们之间的距离（kb）。,EcoR,Hpa,EcoR+Hpa,1.7kb,0.9kb,0.4kb,1.6kb,1.4kb,1.2kb,0.9kb,0.4kb,0.5kb,3.2DNA连接酶,环形DNA分子的发现使科学家相信一定有一种能连接这种Nick的酶存在。,Nick,Nick,1967年，世界上几个实验室几乎同时发现了一种能够催化在2条DNA链之间形成磷酸二酯键的酶DNA连接酶（ligase）。,DNA连接酶：由大肠杆菌基因组DNA编码，以NAD+作为能源辅助因子。；只能连接粘性末端T4DNA连接酶：由大肠杆菌T4噬菌体DNA编码，以ATP作为能源辅助因子。1970年：容易制备，而且可以连接平末端DNA分子及单链DNA(RNA)分子，所以在基因克隆中应用广泛。,DNA连接酶作用的特点,A.连接的两条链必须分别具有3端自由羟基（-OH）和5端磷酸基团（-P），而且只有这两个基团彼此相邻时才能进行连接反应；B.在羟基和磷酸基团间形成磷酸二酯键是一种耗能过程，因此连接反应必须有能量分子的参与，通常有两种能量分子，即ATP和NAD+。,是两条链因此不能将两条单链连接起来或使单链环化起来。OHP是相邻的因此不能封闭gap，只能封闭nick.,gapNO,NickOK,DNA连接酶连接的作用机制,E(酶)ATPEAMPppiE(酶)NADEAMPNMNEAMPDNADNAAMPEDNA上的3OH对被活化的磷原子进行亲核攻击，形成磷酸二酯键，同时释放出AMP。,DNA连接反应的条件,连接反应最佳温度为37，但是此时粘性末端间氢键结合不够稳定，而且酶活性也会迅速降低。比如，EcoRI粘性末端连接部位只有4个碱基对，很容易断开。所以通常在4-15连接。影响连接效率的因素有：A.温度（最主要的因素）B.ATP的浓度(10M-1M)C.连接酶浓度（平末端较粘性末端要求高）D.反应时间（通常连接过夜）E.插入片段和载体片段的摩尔比,粘性末端DNA片段的连接,Nick,Nick,平末端DNA片段的末端加尾连接法,3,3,5,5,3,3,5,5,3,3,5,5,3,3,5,5,AAAAA,TTTT,DNA聚合酶和T4DNA连接酶,同聚物加尾法,用5末端特异的核酸外切酶处理DNA片断,在A和B分别中加入dATP和dTTP,同聚物尾巴1040个碱基,平末端DNA片段加接头连接法,衔接物(linker)，是有人工化学合成的一段10-12个核苷酸的DNA双链，其中包含有1个或几个限制性酶切位点。使用时只须将衔接物和目的片段的5端用多核苷酸激酶处理使之磷酸化，然后用T4DNA连接酶进行连接，就可获得能产生粘性末端的DNA片段。,CCGAATTCGGGGCTTAAGCC,磷酸化,CCGAATTCGGGGCTTAAGCC,P,OH,OH,P,P,P,OH,OH,T4连接酶,CCGAATTCGGGGCTTAAGCC,P,OH,P,OH,EcoRI,CCGAATTCGGGGCTTAAGCC,AATTCGGGCC,CCGGGCTTAA,接头,载体去磷防止自连的应用示例,P,OH,P,OH,OH,OH,OH,OH,P,OH,P,OH,OH,OH,OH,OH,连接酶,连接酶,连接酶,碱性磷酸酶,2Pi,寄主修复缺口,载体自连或产生二聚体等,双衔接物连接法的基本程序,cDNA链的合成,通过DNA聚合酶合成第二链,加入SalI衔接物,SI核酸酶作用后的末端单链突出序列，由Klenow补齐，加入第二衔接物EcolI,衔接物缺点,在用DNA衔接物连接法时，如果待克隆DNA的片断或基因内部，含有与所加衔接物相同的限制位点，在酶切消化衔接物产生粘性末端的同时，也会把克隆的基因切断。,DNA接头（adapter）连接法：1978年，美国康奈尔大学生化分子生物学系的教授吴瑞博士发明的。它是一类人工合成的一头具有某种限制酶粘性末端另一头为平末端的特殊的双链寡核苷酸短片断。粘性末端容易通过碱基配对形成如同衔接物一样的二聚体分子。对DNA接头分子末端，进行必要的修饰。移走粘性末端5-P，暴露出5-OH，不能产生稳定的二聚体分子。,DNA接头,DNA接头连接法,1.大肠杆菌DNA聚合酶I2.Klenow片段3.T4DNA聚合酶4.T7DNA聚合酶5.逆转录酶（反转录酶）6.TaqDNA聚合酶,3.3DNA聚合酶,Kornberg1956年首先从大肠杆菌E.Coli细胞中分离出来的。它是一种多功能性的酶，包括3种不同的酶活力：5-3聚合酶活性以双链DNA为模板，催化单核苷酸结合到引物的3末端，并不断延伸。5-3外切酶活性将双链DNA中游离的5末端逐个切去。3-5外切酶活性将游离的双链或单链DNA的3端降解。不过对于双链的降解可被5-3的多聚活性所抑制。,大肠杆菌DNA聚合酶I（E.ColiDNApolI）,大肠杆菌三种DNA聚合酶特性比较,大肠杆菌聚合酶的应用示例,缺口平移：双链DNA的单链缺口在DNA聚合酶的5-3外切作用下，从缺口的5端逐步水解核苷酸时，酶的聚合活性则利用缺口的3端游离羟基逐个加上相应的单核苷酸，使得缺口向下游移动。,内切酶,大肠杆菌DNA聚合酶I的三种用途,A.制备DNA探针利用其3-5的外切酶活性及其聚合酶活性。B.用于DNA连接后的大缺口填充利用5-3的聚合酶活性。C.用于DNA的序列分析利用5-3的聚合酶活性。,Klenow片段,Klenow片段大肠杆菌聚合酶I全酶经枯草杆菌蛋白酶处理后产生的大片段酶分子，它仍然有53的聚合酶活性和35的核酸外切酶活性，但失去了53的外切酶活性。,Klenow片段的主要用途修补限制性酶消化DNA形成的3隐蔽末端标记DNA片段的末端cDNA克隆中第二链cDNA的合成DNA序列的测定,GAACTTAA,T4DNA聚合酶的特点,T4DNA聚合酶从T4噬菌体感染了的大肠杆菌中分离出来的，它和Klenow片段一样具有53的聚合酶活性和35的核酸外切酶活性。其外切酶活性要比大肠杆菌聚合酶I的活性高200倍。特别是，T4DNA聚合酶还有第三种活力取代反应：如果反应体系中仅存在一种dNTP，这时T4DNA聚合酶就会表现出35外切酶活力，从双链DNA的3开始降解，直到露出和缺乏的那中dNTP互补的碱基，然后就在此位置发生合成和取代反应。,CGTCGCGCAGCG,CGTGCAGCG,dTTP,Mg+,CGGCAGCG,dTTP,Mg+,T4DNA聚合酶的用途,1.以取代反应标记延伸末端（3末端）或平头末端的双链DNA片段2.用于DNA序列分析,T7DNA聚合酶1000倍,逆转录酶Reversetranscriptase,逆转录酶是一种可以有效地将mRNA转录成为DNA的酶，其产物称为cDNA(complementaryDNA).实际上，它也是一种RNA依赖的DNA聚合酶。逆转录酶首先是1970年从鼠白血病毒和劳氏肉瘤病毒中发现的。这两个课题组的论文都发在了同一期的Nature杂志上。主要用途是将mRNA转录成cDNA以制备基因片段。,TaqDNA聚合酶和PCR,总结,1.碱性磷酸酶2.核酸外切酶3.核酸酶S1（nucleaseS1）4.DNase5.RNase6.T4多聚核苷酸激酶7.末端转移酶（terminaltransferase）,3.4其他DNA修饰酶,碱性磷酸酶的特性,从细菌中分离的碱性磷酸酶简称BAP（BacterialAlkalinePhosphatase），从小牛肠中分离的简称CAP（CalfAlkalinePhosphatase）.其主要功能是将DNA或RNA5端的磷酸切除。其主要用途有：A、在用32P标记DNA5端之前，去除5端的磷酸；B、在DNA重组技术中，去除DNA片段的5磷酸，防止载体的自身环化。,载体去磷防止自连的应用示例,碱性磷酸酶(I)与磷酸激酶(II)活性,磷酸激酶的交换反应,T4多聚核苷酸激酶1.催化反应类型1)激酶活性（5-磷酸化酶）：可将ATP中的位的磷酸基转移到ss-DNA，ds-DNA和RNA分子的5-羟基端，在这反应过程中可有两种方式进行（pH7.5-8）.转移反应；.交换反应2)3-磷酸酶活性（pH5-6）2.用途1)5-端末端标记2)分子克隆过程中以获得5-磷酸基末端