生物工程下游技术-细胞分离与破碎2

Chapter2细胞分离与胞内产物的溶解CellSeparationandExtractionoftheProductTrappedintheBiomass,2.1细胞的分离2.2细胞的破碎,2.2细胞破碎(cellmill）,细胞破碎的目的,由于有许多生化物质存在于细胞内部，必须在纯化以前将细胞破碎，使胞内物质释放到液相中，然后方可进行提取,Insomecases,theproductsofinterestarenotinthebrothbutareinthebiomass.Itisintracellular.Releasingthistrappedmaterialusuallyinvolvesrupturingthecellwall,2.2细胞破碎(cellmill）,2.2.1细胞的结构与组成,2.2.2细胞破碎技术,2.2.3目标产物的选择性释放,2.2.4破碎率的评价,2.2.5包含体溶解与蛋白质的复性,2.2.1细胞的结构与组成,革兰氏阳性菌革兰氏阴性菌酵母真菌,革兰氏阳性菌细胞壁,革兰氏阴性细胞壁,酵母细胞壁,细菌细胞壁化学组成,肽聚糖糖：N-乙酰葡萄糖胺,N-乙酰胞壁酸,半乳糖胺氨基酸：D-丙氨酸L-丙氨酸D-谷氨酸L谷氨酸磷壁质：聚核糖醇磷酸酯聚甘油磷酸酯糖：葡萄糖，半乳糖，甘露糖脂质:,酵母与真菌成分,糖及其氨基衍生物：葡萄糖30%甘露糖30%半乳糖岩藻糖葡萄糖胺1-2%氨基酸谷氨酸5-7%天门冬氨酸脂质1-13.5%,葡萄粮胺与胞壁酸,肽聚糖,酵母细胞化学成分,2.2.2细胞破碎技术,原理：压挤撞击剪切化学渗透,压挤,剪切,化学渗透,产物释放,2.2.2.1机械破碎,高压匀浆珠磨撞击超声,高压匀浆,1)：结构和原理高压匀浆器，由高压泵和匀浆阀组成。见图,高压匀浆,2)影响破碎率的因素,见图2.12,3)适用范围和操作注意点酵母和大多数细菌细胞的破碎，料液细胞浓度可达到20%左右，团状和丝状及小的G+菌不适。,珠磨,1)结构与原理-见图2)破碎率动力学方程式3)适用范围和操作注意点大多数微生物的细胞破碎,珠磨,撞击,撞击,声频高于1520KHZ的超声波在高强度声能输入下，利用空化现象(cavitation)引起的冲击波和剪切力使细胞破碎。超声波气泡形成气泡长大破碎超声波的声频、声能、处理时间、细胞浓度及菌种类型均影响破碎效率。缺点：产生化学自由基团氧化产物，且噪声大。,超声波破碎(Ultrasonication),超声破碎,释放方程,2.2.2.2化学和生物化学渗透,酸碱处理化学试剂酶溶,物理渗透,渗透压冲击法冻结融化法干燥法,2.2.3目标产物的选择性释放,(1)仅破坏或破碎目标产物的位置周围(2)选择性溶解目标产物,2.2.4破碎率的评价,直接计数（1）计数器（2）平板计数（3）显微镜间接计数（1）活性测定（2）电导率测定：破碎后，带电荷的内容物释放，使悬浮液的导电率增加。,2.2.5包含体溶解与蛋白质的复性,重组DNA技术实现了大规模生产目标蛋白质，但这些基因重组所产生的蛋白质往往互相交联在一起，形成不溶性的聚积物，称包含体(inclusionbodies,Ibs)。2.2.5.2包含体的性质2.2.5.3包含体的形成包含体的形成为动力学控制过程，可用竞争反应动力学描述,2.2.5.1包含体的概念,U伸展肽链(unfoldedpeptide);I折叠中间态；N天然活性态；A聚集体(包含体),ki中间体生成速率常数;kr折叠速率常数；ka聚集体生成速率常数,UINA,ki,kr,ka,1)在折叠反应中，从伸展态到中间体的形成是非常快速的，一般在毫秒范围内完成，但从中间体转变为天然态的过程比较缓慢，是反应的限速步骤。当溶液中离子强度或变性剂浓度很低，又无其它辅助因子(如人工伴侣)存在时，聚集趋势占主导地位，导致蛋白质的自发复性效率极低。2)目前有两种不同的假设：一种假设认为，肽链中的局部肽段先形成一些构象单元，如螺旋、折叠、转角等二级结构，然后再由二级结构单元的组合、排列，形成蛋白质三级结构；另一种假设认为，首先是由肽链内部的疏水相互作用导致一个塌陷过程，然后经逐步调整，形成不同层次的结构。3)当溶液中离子强度或变性剂浓度很低，又无其它辅助手段存在时，聚集趋势占主导地位，导致蛋白质的自发复性效率极低。,细胞破碎-匀浆离心-回收包含体加入变性剂溶解包含体-可溶性伸展态-除去变性剂-恢复天然构象及活性,2.2.5.4包含体的分离纯化,2.2.5.5蛋白质的复性,1)回收包含体后，加入变性剂溶解包含体，使之成为可溶性伸展态，再除去变性剂使表达产物折叠恢复天然构象及活性。,2)但在实际研究中发现，在体外折叠时，蛋白质分子间由于存在大量错误折叠和聚合，复性效率往往很低。原因是蛋白质的立体结构虽然由其氨基酸顺序决定，然而伸展肽链折叠为天然活性结构的过程还受到周围环境的影响。3)当溶液中离子强度或变性剂浓度很低，又无其它辅助手段存在时，聚集趋势占主导地位，导致蛋白质的自发复性效率极低。4)一般认为，蛋白质在复性过程中，涉及两种疏水相互作用，一是分子内的疏水相互作用，二是部分折叠的肽链分子间的疏水相互作用。前者促使蛋白质正确折叠，后者导致蛋白质聚集而无活性，两者互相竞争，影响蛋白质复性收率。因此，在复性过程中，抑制肽链间的疏水相互作用以防止聚集，是提高复性收率的关键。,2.2.5.6蛋白质复性的初期研究成果,1)80年代后期，人们开展了广泛的蛋白质复性研究。例如，Carlson等发现，单克隆抗体具有协助蛋白质复性的作用；Cleland等发现，向稀释的变性蛋白质溶液中加入适当浓度的聚乙二醇，可抑制蛋白质复性过程中的凝聚沉淀，使蛋白质复性收率提高两倍；Hagen等利用反胶团萃取人工变性的蛋白质后去除变性剂进行复性，复性率可达100%；Batas等利用凝胶过滤色谱介质的分子筛作用可防止变性蛋白质间的接触和凝聚，辅助其正确折叠；Zardeneta等利用去污剂及混合胶团，成功地辅助了脲变性硫氰酸酶复性。,2)1995年，Karuppiah和Sharma发表文章，介绍了使用环糊精辅助碳酸酐酶B的复性。环糊精由淀粉通过环糊精葡萄糖基转移酶降解制得，是由D-吡喃葡萄糖单元以-1，4-糖苷键相互结合成互为椅式构象的环状低聚糖，其分子通常含有612个吡喃葡萄糖单元。有实用意义的是含6、7、8个吡喃葡萄糖单元的、-环糊精，但-环糊精空腔较小，-环糊精价格昂贵，常用的是-环糊精。环糊精的特征是能形成包络化合物，客体分子从宽口端进入其分子空腔。包络物的形成主要靠非共价键相互作用如范德华力、氢键、疏水相互作用、几何形状匹配等。利用环糊精的疏水性空腔结合变性蛋白质多肽链的疏水性位点，可以抑制其相互聚集失活，从而促进肽链正确折叠为活性蛋白质。,3)1999年，Sundari等报道了用直链糊精辅助胰岛素、碳酸酐酶和鸡蛋白溶菌酶复性，发现直链糊精基本上能够模拟环糊精在辅助蛋白质复性方面的作用，而且具有这样一些优点：直链糊精的螺旋结构形成一个疏水性空管，可以结合更多的蛋白质分子；在水中溶解度较高，有利于提高复性酶浓度和实验操作；价格比环糊精便宜，实际应用前景广阔。,4)近来，越来越多的有关蛋白质折叠的研究已转向利用分子伴侣GroE家族。有些学者已成功地利用分子伴侣在体内和体外辅助蛋白质复性。但分子伴侣在实际应用中尚存在费用高并需要与复性蛋白质分离等缺点，因此研究开发分子伴侣的重复利用性及稳定性是实现其应用的关键。GroEL具有结合蛋白质的作用，相当于变性蛋白质的亲和配基。固定化GroEL柱(固定床)相当于变性蛋白质的亲和吸附层析柱，从而可提高样品的处理量，并使蛋白质在复性的同时得到浓缩和纯化。其特点在于：不仅可以解决分子伴侣的重复利用问题，而且由于固定床的利用(近于平推流)，可提高分子伴侣的利用效率；由于采用连续操作，原料处理量大，产品可以得到浓缩、纯化；易于建立相关的模型，对于放大生产具有重要的指导作用。Teshima等利用固定化分子伴侣，在体外辅助了淀粉酶、碳酸酐酶、DNA酶的折叠复性。,5)联合使用去污剂和环糊精作为人工分子伴侣在蛋白质复性中的应用优势：,人工分子伴侣不属于蛋白质，不易受环境影