第一章-微生物工程菌种-2

第二节菌种来源,微生物工程工业生产水平的三个决定要素:,生产菌种的性能发酵和提取工艺条件生产设备,获得优良的生产菌种是实现高水平微生物工程工业生产的第一环节.,一、菌种分离与筛选工作程序,发酵工业上使用的微生物菌种，最初都是从自然界中分离筛选出来的。,分离与筛选菌种的具体做法一般分4个步骤：,调查研究（包括资料查阅）,筛选工作程序,二、分离与筛选的设计要求,在筛选所需菌株时应考虑以下一些重要指标：,1、菌的营养特征,一般要求采用廉价的培养基或使用来源丰富的原料,2、菌的生长温度,3、菌的稳定性,4、菌的产物得率和产物在培养液中的浓度,5、菌对所采用的设备和生产过程的适应性,6、容易从培养液中回收产物,3-6是用来衡量菌种的生产性能，如能满足这几条，便有希望成为效益高的生产菌株,三、含微生物样品的采集,较复杂；应根据分离目的灵活掌握,土壤（丰富、5-25cm、土质、酸碱度、植被状况、地理条件、季节）,食品、海水、动物、植物、极端环境,根据微生物的营养类型采样,森林土中有相当多枯枝落叶和腐烂的木头，富含纤维素，适合利用纤维素作碳源的纤维素酶产生菌生长。,肉类加工厂附近、饭店排污沟，易分离到蛋白酶和脂肪酶产生菌。面粉加工厂等场所易分离到产淀粉酶、糖化酶的菌,根据微生物的生理特性采样,筛选高温酶产生菌通常从温泉、火山爆发处、堆肥等采样；,筛选产低温酶的微生物，可从冰窖、南极、深海等采样分离耐高渗透压酵母菌，可到甜果、蜜饯、甘蔗渣堆积处采样,杨尺蠖,赤松毛虫,侧柏毛虫,四、含微生物样品的富集培养,富集(enrichment)培养是在目的微生物含量较少时，根据微生物的生理特点，设计一种选择性培养基，创造有利的生长条件，使目的微生物在最适的环境下迅速地生长繁殖，数量增加，由原来自然条件下的劣势种变成人工环境下的优势种，以利分离到所需的菌株。,其要领是提供一些有利于所需菌株生长或不利于其他菌型生长的条件。包括：控制培养基的营养成分；控制培养条件；抑制不需要的菌类等。,控制氧可将好氧微生物和厌氧微生物分开；高温下培养可将嗜热微生物和非嗜热微生物分开；控制pH可分离嗜酸或嗜碱微生物；高糖或高盐培养基可分离耐高渗透压微生物；,根据微生物对环境因子的耐受范围具有可塑性的特点，可通过连续富集培养的方法分离降解高浓度污染物的环保菌。如降解苯胺的微生物分离。可以苯胺为唯一碳源对样品进行富集培养，待底物完全降解后，再以一定接种量转接到新鲜的含苯胺的富集培养液中，如此连续移接培养次数。同时将苯胺浓度逐步提高，并可得到降解苯胺占优势的菌株培养液，采用稀释涂布法或平板划线法进一步分离，即可得到能降解高浓度苯胺的微生物。,需注意，所需菌型生长的结果有时会改变培养基的性质，从而改变选择压力。重复移植几次后接种少量已富集的培养物到固体培养基上。移植时间是关键，应在所需菌种确已占优势的情况下进行。,五、利用固体平板的生化反应进行分离,利用特殊的分离培养对大量混杂微生物进行初步分离的方法。分离培养基是根据目的微生物特殊的生理特性或利用某些代谢产物生化反应来设计的。可显著提高分离效率,透明圈法变色圈法生长圈法抑菌圈法,透明圈法,分离水解酶产生菌时较多采用，如蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、核酸酶等；,在平板培养基中加入溶解性较差的底物，使培养基混浊；能分解底物的微生物便会在菌落周围产生透明圈，圈的大小初步反应菌株利用底物的能力。,土壤经巴氏消毒，以减少不产芽孢的微生物；然后铺在pH8-9的琼脂培养基（含有均匀的不溶性蛋白质）表面；碱性蛋白酶产生菌能消化平板上的不溶性蛋白质，产生一透明圈。,例如用此法分离产生碱性蛋白酶的芽孢杆菌,分离某种产生有机酸的菌株时，也通常采用透明圈法初筛在选择培养基中加入碳酸钙，使平板呈混浊状，产酸菌能够把菌落周围的碳酸钙水解，形成清晰的透明圈,聚赖氨酸产生菌（利用产正电分泌物的菌株和美蓝之间的静电作用而形成独特的透明圈,从而灵敏地筛选得到产聚赖氨酸产生菌的菌株),将待测菌株接种于蛋黄培养基平板上培养，在菌落周围产生晕圈（溶脂圈和透明圈）的菌株作为定性筛选解有机磷细菌的判断依据，以晕圈直径与菌落直径比例的大小作为解磷能力大小初筛的判定指标,溶脂圈透明圈,如何筛选磷细菌？,透明圈的大小不能完全作为选择高产菌的依据，因为在深层培养中的产酶单位与平板上圈的大小之间并不完全成正比。但作为初筛的手段是有意义的,2、抑菌圈法,常用于抗生素产生菌的分离筛选,据估计，筛选1万个菌株才能得到1株有用的抗生素产生菌；因此，设计一个准确、快速的筛选模型十分重要。抑菌圈法是常用的初筛方法,工具菌采用抗生素的敏感菌,若被检菌能分泌某些抑制菌生长的物质，如抗生素等，便会在该菌落周围形成工具菌不能生长的抑菌圈,3、生长因子产生菌的分离,通过观察分离菌能否促进营养缺陷型菌株的生长，来检测生长因子产生菌。,分离培养基上培养,被杀死的菌落周围有无检测菌的生长圈,第三节菌种选育,菌种选育应用微生物遗传和变异理论，用人工方法(或自然)造成变异，再经过筛选以得到人们所需菌种的过程。,菌种选育的目的是为了不断提高发酵工业产品的产量和质量，增加新产品和适应工艺改革的要求。,菌种选育的方向是选育“吃粗粮”、耐高温、生长快、代谢旺、产量高、质量好、无毒性的优良菌株。,自然选育诱变育种杂交育种(有性、准性)原生质体融合育种基因工程育种,一、自然选育,在生产过程中，不经过人工处理，利用菌种的自发突变而进行菌种筛选的过程叫自然选育。,自发突变(spontaneousmutation)，也称自然突变，指某些微生物在没有人工参与下所发生的那些突变，但这决不意味着这种突变是没有原因的。,一般认为引起自然突变有两个原因：即多因素低剂量的诱变效应和互变异构效应。多因素低剂量的诱变效应是指自然突变实际上是由一些原因不详的低剂量诱变因素引起的长期综合效应，例如充满宇宙空间的各种短波辐射、自然界中普遍存在的一些低浓度诱变物质以及微生物自身代谢活动中所产生的一些诱变物质（如过氧化氢等）,自然突变两种情况：生产上所不希望的：菌种的衰退和生产质量下降对生产有益的：生产性能提高,制备单孢子（单细胞）悬液适当稀释在固体平板上分离挑取部分单菌落进行生产能力测定经反复筛选以确定生产能力更高的菌株替代原来的菌株,自然选育的一般程序：,自然选育简单易行，可以达到纯化菌种、防止菌种衰退、稳定生产、提高产量等目的。自然选育的最大缺点是效率低、进展慢，很难使生产水平大幅度提高。,二、诱变育种,诱变育种就是人为地利用物理或化学等因素，使诱变对象细胞内的遗传物质发生变化，引起突变，并通过筛选获得符合要求的变异菌株的一种育种方法。,诱变育种不仅可以提高菌种的生产能力，且可改进产品质量、扩大品种和简化生产工艺。,目前发酵工业中应用的生产菌株大部分是诱变育种得来的。以青霉素为例，1943年开始生产时的效价仅为20U/ml，通过多次诱变育种现已达50000-100000U/ml。虽然遗传工程等新的育种方法迅速发展，但诱变育种仍是目前广泛使用的育种手段。,诱变育种的一般步骤,诱变育种的工作程序,一）细菌杂交育种,转导转化接合,三、杂交育种,二）放线菌杂交育种,放线菌和细菌一样属于原核微生物，但却像霉菌那样以菌丝形态生长，且形成分生孢子，所以就本质来说，放线菌的基因重组过程近似于细菌，但就育种方法来说，却有许多与霉菌相似的方面。,放线菌杂交技术,混合培养法玻璃纸法平板杂交法,三）酵母菌杂交育种,酿酒酵母生活史,酵母菌可采用有性杂交育种,制备子囊孢子杂交选择重组子,四)霉菌杂交育种,有性杂交(如根霉)准性杂交(如构巢曲霉、青霉等),四、原生质体融合育种,原生质体融合（protoplastfusion）育种是杂交育种（基因重组）育种的一种特殊方式,通过基因重组可以使基因组成发生较大的改变，随之使生物的性状发生变化。,但对微生物育种来说，有性重组的局限性很大。因为迄今发现有性杂交现象的微生物为数不多，在有工业价值的微生物中则更少；而且即使发生杂交，遗传重组的频率也不高，这就妨碍了基因重组在微生物育种中作用；另外，转化、转导等现象在微生物中亦不普遍。,原生质体融合技术打破了这种不能充分利用遗传重组的局面,一）原生质体融合的概念,就是把两个亲本的细胞分别去掉细胞壁，获得原生质体，将两亲本的原生质体在高渗条件下混合，由聚乙二醇（PEG）作为助融剂，使它们互相凝集，发生细胞质融合，接着两亲本基因组由接触到交换，从而实现遗传重组。,1、大幅度提高亲本之间重组频率。,原生质体剥离了细胞壁，去除了细胞间物质交换的主要障碍，也避免了修复系统的制约；再加上促融剂的诱导作用，重组频率显著提高。,2、扩大重组的亲本范围。,二）原生质体融合育种的优点,如天蓝色链霉菌的种内重组频率可达20%,去除了细胞壁的障碍，亲株基因组直接融合、交换，实现重组，不需要有已知的遗传系统。,3、原生质体融合时亲本整套染色体参与交换，遗传物质转移和重组性状较多，集中双亲优良性状机会更大。,4、可以和其它育种方法相结合，把由其他方法得到的优良形状通过原生质体融合再组合到一个单株中。,一、菌种保藏原理,主要是根据菌种的生理生化特点，人工创造条件，使孢子或菌体的生长代谢活动尽量降低，以减少其变异。一般可通过保持培养基营养成分在最低水平、缺氧状态、干燥和低温，使菌种处于“休眠”状态，抑制其繁殖能力。,第四节菌种保藏,二、保藏方法,1、斜面冰箱保藏法4C；3-6个月2、沙土管保藏法产孢子或芽孢微生物，1年3、菌丝速冻法甘油或二甲基亚砜作为保护剂，-20C4、石蜡油封存法1年左右5、真空冷冻干燥保藏法任何微生物；一般5年以上6、液氮超低温保藏法-196C；保护剂；保存期长,三、国内外重要菌种保藏机构,1、ATCC(AmericanTypeCultureCollection)美国标准菌种收藏所，马里兰州，罗克维尔市2、CSH(ColdSpringHarborLaboratory)冷泉港研究室，美国3、I