生物工程下游技术--沉析

Chapter3沉淀(沉析)Precipitation,3.1概述3.2蛋白质的表面特性3.3蛋白质沉淀方法,3.1概述,4.1.1沉淀(precipitation)概念物理环境的变化引起目的物或杂质的溶解度降低，从而形成不定形固体凝聚物(aggregates)的过程。多用于蛋白质及多糖类等物质的初级分离。3.1.2沉淀法的应用主要应用于生化产物的分离，其典型例子是蛋白质(酶)的分离提取，在实验室和工业规模均得到广泛应用。,3.1.3沉淀法分离蛋白质的特点在生产的前期就可使原料液体积很快地减小1050倍，从而简化生产工艺、降低生产费用；使中间产物保持在一个中性温和的环境；可及早地将目标蛋白从其与蛋白水解酶混合的溶液中分离出来，避免蛋白质的降解，提高产物稳定性；用蛋白质沉淀法作为色谱分离的前处理技术，可使色谱分离使用的限制因素降低到最少。缺点：所得沉淀物可能聚集有多种物质，或含有大量的盐类，或包裹着溶剂，产品纯度较低。,3.1.4一般沉析操作的过程,在经过滤或离心后的样品中加入沉析剂；沉淀物的陈化，促进晶体生长；离心或过滤，收集沉淀物；,3.2蛋白质的表面特性1)、蛋白质为两性高分子电解质(amphotericpolymer)，其正负电荷是由氨基和羧基的离子化形成的。其包含疏水性和亲水性的氨基酸基团，其亲水和疏水区域的分布和程度决定蛋白质在水相环境中的溶解程度。但大部分蛋白质是可溶的，其亲水性氨基酸残基分布在蛋白质立体结构的外表面。蛋白质表面由不均匀分布的荷电基团形成的荷电区、亲水区和疏水区组成。,2)、蛋白质分子周围存在与蛋白质分子紧密或疏松结合的水化层(hydrationshell)，从而使蛋白质在水溶液中呈现稳定的胶体溶液(colloid)而不易沉淀。3)、偏离等电点的蛋白质为带电粒子，在电解质溶液中吸引相反电荷的离子(反离子，counterion)。紧靠蛋白质表面的反离子层不流动(紧密层，Sternlayer)，靠近外围的反离子浓度逐渐降低直至为零(分散层，gouy-Chapmanlayer)，从而形成蛋白质的双电层(electricaldoublelayer)。双电层中存在从表面由高到低的电位分布，由于粒子表面电位一定，所以分散层厚度赿小，双电层交界处的电位赿小。分散层厚度为零，电位为零，粒子处于等电状态，无静电相互作用。当双电层的电位足够大时，静电排斥作用抵御分子间的相互吸引作用，使蛋白质处于稳定状态。,4)、降低蛋白质的水化层和双电层厚度可降低蛋白质溶液的稳定性，使蛋白质沉淀。加入沉淀剂可达到目的。,3.3蛋白质沉淀方法按加入沉淀剂的不同分为：加入中性盐盐析；加入可溶性有机溶剂；将pH值调节到等电点；加入非离子型亲水性聚合物；加入聚电解质絮凝；加入多价金属离子等,选择沉淀方法时，应考虑以下几个因素：沉淀剂是否会引起蛋白质分子的破坏沉淀剂本身的性质、沉淀操作的成本和难易程度、残留沉淀剂的去除难度最终产品的产率及纯度的要求,3.3.1盐析沉淀(Saltinducedprecipitation)1)盐析原理蛋白质在高离子强度的溶液中溶解度降低，从而发生沉淀的现象为Salting-out.,其中：S蛋白质的溶解度，g/dm3；常数；Ks盐析常数；I离子强度，mol/dm3；ci离子i的摩尔浓度(mol/dm3)；Zi电荷数Ks为直线的斜率，由蛋白质和盐的种类决定，与T，pH无关；当I为0时，logS，即为纵向延伸截距，与蛋白质、T、pH有关，与无机盐无关。,Cohn,KsS盐析效果好ci和、Zi增大,S盐析好等电点下min,T好,盐离子与蛋白质表面异电荷结合离子对电性降低降低电排斥,低浓度的盐离子电荷增加促溶盐溶现象(Saltingin),高浓度：,脱水膜蛋白质暴露出疏水小区溶解度降低沉淀,2）盐析方法Ks盐析法：一定的pH和T下通过改变盐离子浓度进行盐析，此时影响较小，此法由于蛋白质对离子强度的变化非常敏感，易产生共沉淀现象，沉淀的分辨率低，故常用于提取液的前处理。盐析法：一定的盐离子浓度下改变pH和T进行盐析，影响较大，用于后期，分辨率高。,3）影响盐析的因素盐的种类和浓度：即Ks值不同，一般是多价阴离子、单价阳离子的盐析作用强。即浓度愈大，共沉作用加强，分辨率降低，效果降低，一般23%。温度与pH值影响值,4）盐析剂的选择盐析作用强；溶解度大，且受温度影响小；具生物惰性，来源丰富，价格低廉；盐溶液密度低，便于蛋白质沉淀的沉降或离心；,5)盐析操作硫酸铵的加入：工业规模直接加入，或分批加入，连续搅拌小规模加入饱和溶液，以避免局部过浓，但料液稀。硫酸铵加入量的表示饱和度：25下其饱和浓度4.05mol/L(761g/L水)加入量：分别为20及0下使1L蛋白质溶液发生盐析时硫酸铵的摩尔浓度从M1M2所需加入的硫酸铵量（克）。若硫酸铵浓度用饱和溶解度S表示，则,所需的硫酸铵浓度或饱和度的确定通过测定盐析沉淀平衡后上清液中蛋白质浓度与硫酸铵饱和度的关系图来确定。6）应用人干扰素、白细胞介素、单克隆抗体等。,3.3.2等电点沉淀法1）原理（Isoelectricprecipitation）PI下，分子表面净电荷为零，双电层和水化层受破坏分子引力大于电荷排斥力蛋白质溶解性降低。调节体系pH值，使两性电解质的溶解度下降，析出的操作称为等电点沉淀2）特点：消耗试剂少，且无需脱盐后处理，但由于在等电点附近，溶质仍然有一定的溶解度，等电点沉淀法往往不能获得高的回收率，因此等电点沉淀法通常与盐析、有机溶剂沉淀法联合使用3）适用：疏水性较大的蛋白质（酪蛋白）,操作时的注意事项：（1）生物大分子的PI受盐离子的影响发生变化，蛋白质的等电点通常会发生“漂移”，阳-高，阴-低（2）在使用等电点沉析时还要考虑目标物的稳定性，有些Pro在pI处不稳，如-糜蛋白酶(pI8.18.6)，但在中性及偏碱环境易水解而失活，故实际操作用pH5（3）生物大分子在pI附近盐溶作用很明显，所以无论是单独使用或与溶剂沉析法合用，都必须控制溶液的离子强度。,3.3.3有机溶剂沉淀,概念：在含有溶质的水溶液中加入一定量亲水的有机溶剂，降低溶质的溶解度，使其沉淀析出。原理：（1）降低了溶质的介电常数，使溶质之间的静电引力增加，从而出现聚集现象，导致沉淀。（2）由于有机溶剂的水合作用，降低了自由水的浓度，降低了亲水溶质表面水化层的厚度，降低了亲水性，导致脱水凝聚。,有机溶剂沉析的特点,分辨率高；溶剂容易分离，并可回收使用；产品洁净；容易使蛋白质等生物大分子失活；应注意在低温下操作；成本高,溶剂选择,介电常数要小致变性作用要小（甲醇）毒性要小、挥发性适中水溶性要好,常用的有机溶剂沉析剂,乙醇：沉析作用强，挥发性适中，无毒常用于蛋白质、核酸、多糖等生物大分子的沉析；丙酮：沉析作用更强，用量省，但毒性大，应用范围不广；特点：介电常数小，60%乙醇的介电常数是48丙酮的介电常数是22容易获取,影响有机溶剂沉析的主要因素,温度：低温有利于防止溶质变性；有利于提高收率（溶解度下降）；搅拌速度：散热溶液pH值：原则是避免目标蛋白与杂质带有相反的电荷，防止共沉现象。（pI）离子强度:离子强度低有利于沉析，0.010.05mol/L样品浓度:0.52%稀：溶剂用量大，回收率低，但共沉淀作用小浓：节省溶剂用量，共沉作用强，分辨率低金属离子的助沉析作用：Zn2+、Ca2+,应用实例,胰岛素粗品溶液,调pH4.2,沉淀,上清液调pH至6.0,杂蛋白,沉淀胰岛素,上清液回收,30%丙酮,3.3.4其它沉淀法,水溶性非离子型聚合物沉淀剂成盐类复合物沉析剂离子型表面活性剂离子型多聚物沉析剂氨基酸类沉析剂分离核酸用沉析剂分离粘多糖用沉析剂选择性变性沉析法,水溶性非离子型聚合物沉淀剂,PEGThisformofprecipitationinvolvestheadditionofanon-ionicpolymertotheproteinsolution.Thisworksbecausetheadditionofthepolymerreducestheamountofwateravailabletointeractwiththeprotien.Thepolymersthathavereceivedthemostattentionhavebeendextransandpolyethyleneglycols.,成盐类复合物沉析剂,此类沉析剂有以下三种：（1）高价金属盐：Cu2+，Ag2+，Zn2+，Ca2+与酸性基团结合；（2）苦味酸盐、单宁酸盐、鞣质等，与碱性基团结合（3）无机复合盐：磷钨酸盐、磷钼酸盐等缺点：容易导致活性蛋白的不可逆变性,Inthistypeofprecipitation,ametalionwillbindtoapartoftheprotein.Anadvantageofthistypeofprecipitationisthattheyhavegreatprecipitatingpowerinadilutesolution.Theseionscanbeclassifiedintothreegroups.IonssuchasMn2+,Fe2+,Co2+,Ni2+,Zn2+,andCd2+willbindstronglytocarboxylicacidsandtonitrogenouscompounds.Ca2+,Ba2+,Mg2+,andPb2+willmainlybindtocarboxylicacids.Finally,Ag+,Hg2+,andPb2+willbindstronglytosulphydrylgroups.,金属离子沉析,离子型表面活性剂,十六烷基三甲基季铵盐的溴化物（CTAB）主要用于沉淀酸性多糖十二烷基磺酸钠（SDS）主要用于沉淀膜蛋白和核蛋白,离子型多聚物沉析剂,是一类温和的沉析剂，与目标蛋白成盐。核酸（多聚阴离子），用于碱性蛋白的沉淀；鱼精蛋白（多聚阳离子），用于酸性蛋白的沉淀；,粘多糖沉淀剂,CTAB(十六烷基三甲基季铵盐溴化物)与多糖上的阴离子形成形成季铵络合物，降低离子强度，络合物析出。,分离核酸用沉析剂,酚、氯仿、十二烷基磺酸钠等目的是使核酸和蛋白质分离，蛋白质变性沉淀，核酸则存在于水溶液中。,选择性变性沉