第八章-生物工程育种

第八章基因工程育种,一、意义：自80年代Palmiter等将外源生长激素（GH）基因导入小鼠获得快速生长的超级小鼠以来，应用转基因技术获得具有速生、抗病、优质等性状的优良品种引起了人们的极大兴趣，相继开展了兔、鱼、鸡、猪、羊等动物的基因转移。转基因动物研究已成为一个极具潜在价值的生物医学研究新领域。外源基因的导入已成为研究基因调控、发育分化、组织特异表达、培育生物新品种的一个有力手段，其发展潜力和应用前景受到广泛的重视。,第一节、转基因研究概况,世界第一只转基因动物,转基因“硕鼠”（右）,1、转生长激素,转基因鱼,转基因牛,转基因猪,2.动物生物反应器,能生产人促红细胞生成素的转基因牛,乳汁中分泌人凝血因子IX的转基因山羊,转基因动物的出现引导人们试图把转基因动物作为一种生物反映器，生产人类所需的医用珍贵稀有蛋白，特别是医用活性肽。,3.异种器官移植,英国苏格兰罗斯林研究中心培育出的5只转基因小猪通过基因工程的手术，将猪的一个基因阿尔法1号(GT基因)“关闭”,世界首只转基因灵长类动物-安迪,第一只商业化转基因羊分泌抗胰蛋白酶,4、表达调控、观赏,二、基因工程的概念geneticengineering,定义：又称为重组DNA技术，指将某些特定的基因或DNA片断，通过载体或其它手段送入受体细胞，使它们在受体细胞中增殖并表达的一种遗传学操作。目的:是生产出符合人类需要的产品或创造出生物的新性状，并能稳定遗传。,三、基因工程技术路线,1、DNA片段的取得（目的基因的分离和制备）2、DNA片段和载体的连接重组体DNA3、外源DNA片段引入受体细胞基因克隆和基因文库4、选择基因（目的基因）5、目的基因表达,切接转选表达,从转基因的技术手段来看，除DNA显微注射法外，人们先后试过反转录病毒载体介导法、精子介导法、胚胎干细胞介导法和核移植法等多种转基因方法。转基因细胞的核移植技术已经成为转基因动物生产的主流方法。,1、从简单的显微注射法向高效率的转基因体细胞核移植方向发展,四、发展的趋势,转基因在基因组中的存在方式有两种，即随机整合和定点整合。为了达到外源基因的高效表达，在转基因结构上增加了含有位点控制区（LCR）、核基质附着区(MAR)等调控元件，可以实现插入位点非依赖性、拷贝数相关的表达模式。LCR和MAR的功能不受种属差异的限制，无论外源基因插入什么位点，都能够维持一个开放的染色体结构，有利于基因的表达。基因打靶技术的出现与发展，实现了对目的基因的定位操作。,2、从外源基因随机插入（或整合）到定点整合的转变,从转基因的策略来看，动物转基因技术的发展经历了两个阶段：第一阶段为传统转基因动物阶段，第二阶段为条件性转基因动物阶段。借助转基因技术可将单一的功能基因和基因簇引入高等动物的基因组，或将目的基因从动物基因组中敲除，实现了种系内和种系间基因转移或修饰，产生新的基因型和表型。目前转基因动物主要应用在生物学基础研究、医学疾病模型、动物生物反应器、异种器官移植、动物遗传改良等个方面。,、从传统转基因到条件控制的转变,五、水生动物的转基因研究水生动物方面的转基因研究，目前主要集中在转基因鱼的研究上。从1985年朱作言等报道了转基因鱼的工作以来，已将多种外源基因导入鲑鱼、鳟鱼、斑马鱼等。研究的目的主要有两方面：一是进行诸如生长激素（GH）基因、抗冻蛋白（AFP）基因、病毒外壳蛋白基因等外源基因转基因动物研究，旨在通过外源基因的转移，使养殖动物获得抗冻、抗病、生长快速等新的生产性状，改良养殖品种的品质。另一方面的研究目的是利用转基因手段解决发育生物学和分子生物学问题。,如Du等采用美洲大绵尉抗冻蛋白启动子鲑鱼生长激素cDNA，将其转移进鲑鱼，成功地获得了比对照生长速率快46倍的转基因鱼，最大为对照的13倍（Du,etal.,1992）。如Ozato等研究了鸡晶状体蛋白基因在青胚胎中的表达，以及表达与发育过程的相关性（Ozato,etal.,1986）。还有研究不同启动子基因重组体在转基因鱼中的表达特性，以及一些在发育和生理上重要的基因（如生长激素基因）在发育中的调控作用（Stuart,etal.,1988;McEvoyg,etal.,1988）。,六、转基因植物,第二节转基因动物技术,一、动物基因工程载体二、基因转移技术,基因工程技术路线,（一）DNA片段的获得,1、从基因所在的生物体直接取得限制性内切酶（restrictionenzymes）2、人工合成DNA片段（DNA合成仪）3、PCR反应合成DNA4、mRNA反转录成cDNA，RACE技术5、基因组文库和cDNA文库,GenomeDNA,TotalRNA,（二）动物基因工程载体,质粒型表达载体病毒载体定向打靶载体,1.质粒型表达载体,表达载体的共同特点是都带有原核复制区和选择性标记基因，保证重组DNA分子能够在大肠杆菌中扩增，同时也必须包括能在真核细胞表达的相关组件。一般包括转录外源DNA序列的启动元件、转录产物有效地加上poly（A）尾巴所必需的信号序列、真核细胞中的选择性标记，另外还增加了一些附加元件，如增强子、内含子、剪接供体与受点，以保证外源基因的高效表达。,重组质粒构建,载体是指携带靶DNA片段进入宿主细胞进行扩增和表达的工具。质粒是指一种存在于细胞内能独立复制的染色体外的DNA。,1)质粒图谱登记号：00522)质粒名称：pBudCE4.13)来源：Invitrogen4)用途：真核表达载体5)详细资料6)是否可以共享7)联系方式：PM,重组质粒的构建过程,重组基因的鉴定,抗性筛选法：能否生长；蓝色和白色菌落，其中白色菌落可能含重组质粒。PCR：双酶切：,体外表达,*在原核生物中的表达：细菌、酵母,在真核生物细胞中的表达：人工培养肝细胞、上皮细胞,人工培养的人成骨细胞,人成骨细胞内的pEGFP蛋白表达,2.病毒载体,作为基因转移的病毒载体须具备以下基本条件：携带外源基因并能够包装成病毒颗粒介导外源基因的转移与表达对机体不致病,（1）腺病毒（adenovirus）,腺病毒作为转染载体有许多特点：基因组的重排率低外源基因与病毒DNA重组后能遗传几个周期安全性好，不会整合到人的染色体上，不导致肿瘤的发生宿主范围广，对受体细胞是否处于分裂期要求不高外源基因在载体上容易高效表达,（2）腺相关病毒（adeno-associatedvirus,AAV）,腺相关病毒是一种天然复制缺陷型非致病性单链DNA病毒，其复制需要有辅助病毒的共转染。无共转染时，野生型AAV优先（70%）整合在人染色体的19q13.3位点处，潜伏存在直至被辅助病毒拯救出来。其整合需要基因组两端的ITR，以及非结构基因编码的蛋白Rep78和Rep68的存在。,AAV具有以下几个方面特点：非致病性、无免疫原性和无炎症反应能感染静止期的细胞，如神经元细胞插入的外源基因表达时间长，一般能够达到1年之多宿主范围广热稳定性强，容易通过灭活辅助腺病毒纯化,（3）反转录病毒,反转录病毒是一种整合型单链RNA病毒，感染宿主细胞后，病毒颗粒中的pol基因表达出反转录酶，以单链的RNA基因组为模板，立即转录出一份线形双链DNA复本，然后在整合酶（Int）介导下，整合到宿主的基因组内，此时整合的病毒序列被称为前病毒。反转录病毒基因组整合到宿主细胞基因组后，其DNA随宿主DNA的复制而复制，并由5-LTR中的一个强启动子转录出病毒RNA链，它既是病毒基因组，同时又具有mRNA模板活性，翻译出结构蛋白和反转录酶。在宿主细胞质中，两条相同的RNA链和反转录酶被包装与内壳中，形成的成熟病毒颗粒以芽植方式分泌至细胞外，但通常不致死宿主细胞。,3.定向打靶载体,基因打靶是通过外源基因与靶细胞染色体上的同源序列间的同源重组，将外源基因定点整合到靶细胞特定位置上，而使某一个特定位点上的基因发生定点突变的技术。在细胞内存在两条相同的DNA链（同源染色体），在细胞内酶的作用下，可以将其切开，发生交叉，然后重新连接，从而发生DNA链的交换并引发重组。,(1)基因敲除的基本程序,构建打靶载体1）同源序列2）打靶载体常含两种筛选标志neor：新霉素抗性基因，阳性筛选标志。当重组后，细胞能在含新霉素的培养基中生长。,HSV-tk：单纯疱疹病毒的胸腺嘧啶激酶基因，阴性筛选标志，该基因产物可分解单核苷酸类似物而生成毒性产物，产生自杀效果。,随机整合,同源重组,（1）基因敲除（knock-out）,敲除型载体由两段与基因组内靶基因座序列同源的DNA片段（又称同源臂）组成，中间为正向选择标记，同缘臂外侧为真核细胞中的负选择标记及在原核细胞中进行复制与筛选的载体DNA序列。,（2）基因敲入（knock-in）,基因敲入是利用同源重组原理将外源基因插入到染色体的特定位点上。基因敲入的转基因结构设计上相似于基因敲除结构，但区别在于：或用外源基因替换并失活靶基因或在不影响原基因功能的前提下插入新的基因或在染色体上特定位点插入新的外源基因，从而实现基因转移，并使得外源基因高效表达,（3）基因下调（knock-down）,RNA干扰（RNAinterference，RNAi）又被称为基因下调，通过干扰RNA（smallinterferencesiRNA）分子的作用达到转录后基因沉默的效应。siRNA的制备方法主要包括体外合成siRNA和siRNA表达载体两种。体外合成的siRNA易转染细胞，进入细胞后，可直接发挥作用，一般不存在siRNA表达载体的转录效率低及细胞毒性等问题。但是体外合成的siRNA只能瞬间干扰，不能达到长久抑制病毒的效果。,大规模随机基因剔除基因捕获(genetrapping)精细突变的引入打了就走策略(HitandRun法)双置换法(DoubleReplacement)“标记和置换”法(TagandExchange)利用Cre-LoxP系统引入点突变条件性基因打靶时空特异性基因打靶（spatiotemporalgenetargetingSTGT）Cre/LoxP和FLPfrt系统染色体组大片段的删除和重排,（三）、基因转移技术,物理转染法化学转染法生物法,基因转移技术的进展1、DNA显微注射法2、反转录病毒载体支持的基因转移3、电脉冲法4、利用转化的全能胚胎干细胞形成生殖系嵌合体的基因转移5、介导法：脂质体介导、钙离子介导、PEI(polyethylenmine)6、精子载体法,1.物理转染法,（1）电击法（electroporation）其基本原理是在外加电场的作用下，细胞膜电位发生改变，细胞质膜瞬间出现可逆性的电穿孔，从而使一定数量的外源DNA从细胞外扩散到细胞质和细胞核内，并进一步整合到宿主DNA上，达到转基因目的。,（2）显微注射法是将外源DNA在显微镜操作系统的辅助下，通过玻璃微管直接将外源DNA注入哺乳动物受精卵的原核内，使外源基因整合到基因组上，制备转基因动物。,胚胎干细胞基因转化法(引自G1ick皱纹盘鲍是3.C，而不是0.C。同样，热休克温度也不宜过高，也应控制在亚致死温度范围。,(3)水静压力休克在较高的流体静压力下，正在分裂的受精卵可返回单个细胞阶段，即使第一极体或第二极体不能排出。高静压力主要作用于微管系统，使微管解聚，微管所保持的结构失去原有的空间构型和刚性。当压力除去后，这些结构一般还能恢复。在高静压下细胞质不能分裂，但染色体不受影响，可继续分裂，最终形成多倍体。水静压力休克已成功诱导产生太平洋牡蛎三倍体和皱纹盘鲍二倍体。将被激活的受精卵放一合适密闭容器中，加压40-60MPa，持续l0min。高静压力可阻止正常细胞的减数分裂或有丝分裂。水静压的处理强度与处理的受精卵大小有一定的关系。,（4）电脉冲处理在一定的电场条件下，细胞会发生融合。在电场强度为600V/cm的条件下，处理时间为50200ps，脉冲数为16，牡蛎和贻贝三倍体产率分别为的，55%和36%，四倍体的产率分别为20%和36%。,2、杂交方法远缘杂交草鱼x鳙的杂种是三倍体。亚马逊鳉x黑花鳉的杂种是异缘三倍体。直接诱导三倍体所面临的两个问题是难以克服的，一是畸形胚的比率较高，二是三倍体的产率不稳定。为了解决三倍体的应用问题，四倍体可望是最佳的途径，即通过生产批量四倍体，然后再与二倍体杂交，以间接的方式获得三倍体。在理论上，四倍体群体可自繁，与二倍体杂交可产生100%的三倍体群体，而其成活率亦可望与二倍体相近。,（二）、四倍体1、第一次卵裂的抑制2、细胞融合3、早期休克处理在一些三倍体试验中用精子激活后立即进行休克处理会诱导产生一定数量的四倍体。4、对可性成熟三倍体牡蛎的卵子进行诱导。,三、多倍体的鉴定技术在不同的实验对象和条件下，倍化率和倍化个体的染色体数往往不同。因此，对处理群体的倍性鉴定是多倍体育种的不可缺少的技术。鉴定倍性的主要方法有:极体计数法、染色体计数法、流式细胞仪法(流仪)、显微分光光度法、核体积法和电泳法等。,1、极体计数法极体计数法已作为一种简单快速的方法用于早期胚胎三倍体的检测。因为三倍体的诱导或是通过阻止第一极体或是通过阻止第二极体的排出，所以三倍体合子只有一个极体而不是两个。,2、染色体计数法染色体计数法同计数法同其他检验技术相比最直观，所获的信息量也较大。不管在胚胎发育到哪一阶段，都可进行染色体计数。稚贝和成体的组织也可用于倍性检测。,牡蛎染色体计数：,二倍体长牡蛎中期染色体2n=20三倍体长牡蛎中期染色体3n=30,三倍体长牡蛎染色体核型二倍体长牡蛎染色体核型,3、流式细胞仪法流式细胞仪倍性检测方法是用对DNA-RNA具特异性的荧光染料对细胞核进行染色。细胞解离制成悬液后，用激光激发，然后通过细胞荧光分析仪的光敏区，其荧光强度就会被显示出来。4、DAPI显微萤光技术DAPI是一种芳香族荧光物质，对DNA腺嘌呤-胸腺嘧啶碱基对非常容易染色。实验样品用DAPI处理并用紫外光(365nm)激发，然后用微量光度计测量荧光强度，荧光强度与相对样品核DNA的含量呈正相关。,三倍体长牡蛎细胞流式仪鉴定结果,细胞核仁数目法,三倍体长牡蛎鳃细胞核仁二倍体长牡蛎鳃细胞核仁,二、性控技术,性别控制就是根据生产上的某些需要创造单性种群，它在鱼类养殖业上具有广泛的应用前景和重要的生产意义，可以归纳如下:一是可以加快鱼类养殖群体的生长速度。许多鱼类雌雄之间的生长速度有明显的差别。二是可以控制繁殖。进行性别控制可以防止鱼的过度繁殖，减少交配时能量的消耗。三是能够延长养殖鱼类群体的有效生长期。四是可以满足特殊需求。有些鱼的鱼卵。,（一）鱼类的性别1)雌雄异体(Gonochorism)指鱼类的一个个体只存在精巢或卵巢一种性腺，在个体发育阶段只表现为单性性征，大多数鱼类属这种类型，又分为未分化型和分化型。前者性腺先发育成卵巢样性腺，然后约有一半个体形成雄性，另一半形成雌性;后者未分化的性腺直接发育成精巢或卵巢。2)雌雄同体(Hermaphroditism)指同一个体具有可区分的卵巢和精巢，并分别产生卵子和精子，一般情况下精子和卵子并不同时成熟，而是轮流成熟，或是卵先成熟，或精子先成熟，以防止自体受精。如黑鲷、石斑鱼就是雌雄同体，黑鲷2一3龄时雄性成熟排精，3龄后转为雌性成熟、排卵，石斑鱼则正好与黑鲷相反。,3）鱼类性别决定决定鱼类性别的染色体机制比较复杂，从目前的研究来看，几乎包括了所有性染色体类型。下面仅介绍一下较常见的XX/XY，ZW/WW和XO/XX型及只在鱼类中存在复性染色体型。XX/XY型此种类型常见于哺乳类。雄性为异配，产生两个不同的配子，雌性为同配，产生两个相同的配子，大多数鱼类属之，如虹鳟、莫桑比克罗非鱼、尼罗罗非鱼、牙鲆和鳞纯类的鱼类。ZW/WW型这种类型在鸟类中常见，其与XX/XY型正好相反，雄性是异配，而雄性为同配，这一类型的鱼有日本鳃、奥利亚罗非鱼、欧洲鲤等。,XO/XX型这是昆虫中常见的性染色体型，即雌雄性染色体数目不同。一般来说XO多半是雌性，雄性为同配，如缎虎鱼科、灯笼鱼科中的几种鱼类。另一种情况是，雌性为同配，而雄性只一个性染色体。少数几种深海鱼类，如星光鱼、夜叮鱼等。复性染色体型性染色体型多半为X1X1X2X2/X1X2Y。属此类的鱼有墨西哥鳞科鱼、红大麻哈鱼、花鳅以及绿鳍马面鲀等。,（二）鱼类的人工性别控制1、单性发育(Parthenogenesis)是指仅在雌核或雄核控制下发育，形成单性后代的一种特殊有性生殖方式，依次称为雌核、雄核发育。(1)雌核发育(Gynogenesis)雌核发育与孤雌生殖和杂种发育不同，需要同种或异种精子进入卵内，不过这些精子只起激动作用，不形成雄性原核，并不参与发育，也没有两性原核融合，卵子的发育完全是在雌核的控制之下进行的，因此得到的后裔全部是母性性状，基因型与母本相同或略有差异。人工也可以诱发动物卵子雌核发育。已先后在金鱼、库页乌鳟、鲤鱼、石鳃、溪鲤、草鱼、斑马鱼、牙鲆和真鳃等20余种进行过研究。,1)人工诱导的机理雌核发育分两种:一种是极体雌核发育(Polarbodygynogenesis)又称杂合子雌核发育。二倍化是通过抑制Pb2完成的;一种是有丝分裂雌核发育(Mitoticgynogenesis)又称纯合子雌核发育，二倍化是通过阻止第一次卵裂实现的。1981年由Streinger采用纯合子法首先在斑马鱼上成功建立纯合子以来，又有许多学者如Koman等分别在牙鲆、鳃鱼、青鳉鱼、罗非鱼上获得成功。,2)诱导方法精子染色体的遗传失活方法也包括生物学方法、物理学方法以及化学方法。生物学方法-远缘杂交远缘种的精子激活卵子但不参与发育也能产生雌核发育后代。如用银大麻哈鱼X溪红点鲑，其雌核发育率占49.2%。这种方法前提是所选的异源精子应不参与受精卵的发育。不过现在有一些学者却提出可以利用精子遗传物质不完全灭活而把一些特定的基因导人受精卵中，进行定向的转基因，已在虹鳟、大麻哈鱼、草鱼等中进行了实验。获得了肯定的结果。,物理方法射线不但能使精子染色体失活而不损伤其受精能力从而诱发卵子进行雌核发育，而且随着照射剂量的增加，胚体成活率起初较低，尔后增高（Hertwig效应）。X射线射线具有较好的穿透力适于大量精子的处理，作用原理是诱发染色体断裂。紫外线相对于上述两种射线，便宜且安全又容易操作，适于生产，它的作用原理是使DNA上的氢键断裂，导致DNA局部变形，影响DNA的正常复制和转录。,现介绍一下紫外线照射的具体步骤:首先应根据实验鱼的Hertwig效应曲线来确定照射剂量，因为不同的鱼照射剂量相同所得效果并不一致。I.将精子稀释液先预冷;II.采取精液1ml，用稀释液稀释50100倍，Rings液，鱼的生理盐水;III.放入培养皿中要平不要太厚一般2-3mm;IV.将培养皿置于摇床振动，使精液照射均匀;V.用紫外灯照射（30W,15cm，照30s2、3min）。,化学方法用特殊的药品某些染料如甲苯胺盐、乙烯脲、丫啶黄等也可以导致精子的染色体失活，但使用较少。此外在实验室中，也可以利用玻璃针刺激鱼卵或用弱电流来处理鱼卵，诱发鱼卵发育。,二倍化用染色体失活的精子激发鱼卵获得的胚胎单倍体，其胚胎发育开始尚属正常到了器官发生期，眼睛及其他器官发生异常，胚体明显缩短、扭曲，尾部粗短，即使孵化也不能成活，即所谓的单倍体综合征。因此必须采用一定的方法在早期使受精卵二倍化，胚胎才能正常发育和孵化，通常采用的方法有:,I.物理学方法温度休克法需要掌握的影响因素是处理时刻、处理时间和处理温度三个要素，处理时刻则据所要诱导的目的分为两个时相:i.Pb2的抑制ii.抑制第一次卵裂水静压法如前所述，水静压法需要特殊的设备水压机，由于其处理时间短、对胚胎损伤小、压力传导均匀、诱导率高，对冷、温水性鱼类都适用而被广泛采用。,II.化学方法用化学药品诱发雌核发育二倍体的报道比诱导三倍体的少。将兴国红鲤或红镜鳃卵子用经紫外线照射过的精子激活3min后，置于0处理30min，可使雌核发育二倍体率达到17.4%，若用25或10010-6。的秋水仙碱溶液浸泡2胞期的卵子30min，其诱导率可提至39.6%。I