液相色谱柱的应用与维护

,液相色谱柱的应用与维护,月旭材料科技（上海）有限公司技术部经理：陈再aijiechen,LC色谱柱的选择热点应用LC色谱柱的维护,色谱柱的选择,高效液相色谱柱发展史,19世纪70年代中期，10m的无定型硅胶颗粒。80年代：粒径为510m球形硅胶。90年代早期：粒径为5m的高纯硅胶。90年代后期：发展了3m或3.5m的球形硅胶。21世纪早期：粒径小于2m的填料被开发出来，发展出了整体柱、无机和有机杂化硅胶。目前，市场上流行的分析用的HPLC硅胶基质填料主要为B型硅胶。,优秀的色谱柱是一切的开始,液相色谱柱的结构,结构：（厂家之间略有不同）柱体：不锈钢，玻璃，聚四氟乙烯等填料：化学键合的硅胶，树脂，凝胶等滤帽：不锈钢烧结成不同孔径的筛板+PEEK帽子柱头螺丝：与柱体匹配的螺帽塑料堵头：各种颜色的塑料螺钉,色谱柱选择-不同的基质,硅胶基质A型无定形，纯度较低B型球形高纯度硅胶E型Ec型极性基团封尾Eb型十八烷基中嵌入极性基团其它型空间位阻保护、多键键合技术、杂化颗粒技术等高分子微球苯乙烯-二乙烯基苯共聚物(PS-DVB)、聚乙烯醇、聚酯、DVB等微粒多孔碳天然“反相”填料氧化锆三氧化二铝无机载体包覆聚合物其它,反相（非极性）键合相不同链长的烷基（C1C30）、苯基（氟代苯基、苯丙基、苯基己基等）、等正相（极性）键合相硅胶（SiO2）、氨基（NH2）、二醇基（Diol）、氰基（CN）等离子交换键合相阳离子交换剂（磺酸基或羧酸基）、阴离子交换剂（季铵基或氨基）手性键合相蛋白类，环糊精及其衍生物类、糖类、纤维素类、淀粉类等等,色谱柱选择-不同的键合相,分离的机理,极性电荷分子大小,基于极性的分离,相似相容样品中和固定相柱填料极性相似的化合物将被填料强烈吸引而延迟出峰，而和流动相极性相似的化合物将被流动相吸引而较快出峰。,基于极性的分离,正相色谱固定相的极性大于流动相。常用于分离中等极性和极性较强的化合物(如酚类、胺类、羰基类及氨基酸类等）。固定相：SIO2、二醇基、氨基、氰基等；常用的流动相：正己烷、异丙醇、乙酸乙酯、乙醇等弱极性溶剂；,基于极性的分离,反相色谱固定相的极性小于流动相。适用于分离非极性和极性较弱的化合物。固定相：C30、C18、C8、C4、苯基等；常用的流动相：水、甲醇、乙腈、四氢呋喃等极性溶剂以及各种缓冲盐。,月旭公司反相色谱柱的选择流程,基于极性的分离,亲水作用色谱HILIC是正相色谱的一种变化；适用于分离和洗脱在正相模式下强保留或反相模式下弱保留的极性化合物；固定相：SIO2、二醇基、氨基、氰基等；常用的流动相：水、甲醇、乙腈等极性溶剂以及各种缓冲盐。,基于电荷的分离,离子交换色谱用离子交换原理和液相色谱技术的结合来测定溶液中阳离子和阴离子;固定相易离子化的官能团（磺酸基、季铵基、羧酸基、二乙氨乙基）键合在硅胶或者聚合物基质上；流动相各种缓冲盐水溶液、甲醇、乙腈等,基于分子大小的分离,排阻色谱法-（凝胶过滤色谱法（GFC）和凝胶渗透色谱法（GPC）利用分子筛对分子量大小不同的各组分排阻能力的差异而完成分离。分离高分子化合物，如组织提取物、多肽、蛋白质、核酸等固定相凝胶（葡聚糖凝胶、羟丙基葡聚糖凝胶）流动相GFC：有机溶剂；GPC：水。,色谱柱的参数,柱长，内径：例如250*4.6mm等粒径：3um,5um,10um等孔径：100A，120A，200A，300A，等比表面积：180m2/g-350m2/g（Ultimate为320m2/g）基质：硅胶，聚合物等硅胶表面性质：载碳量，10-20%(UltimateC18为17%)键合相：C18,C8,CN等封尾：双峰尾pH稳定性：如Xtimate系列为1.012.5,色谱柱的参数,柱长，内径：例如250*4.6mm等粒径：3m,5um,10um等孔径：100A，120A，200A，300A，等比表面积：180m2/g-350m2/g（Ultimate为320m2/g）基质：硅胶，聚合物等硅胶表面性质：载碳量，10-20%(UltimateC18为17%)载氮量，4%键合相：C18,C8,CN等封尾：双峰尾pH稳定性：如Xtimate系列为1.012.5,硅胶性质,-纯度高纯硅胶（99.999%）,对碱性和强极性化合物的分离有极大的影响,MSi,O-H,内部的金属对表面硅羟基具有活化作用,强酸性,-硅羟基硅羟基的酸性较大，可与碱性化合物由于静电作用力而牢固的结合，因此含有较多残留硅羟基的填料在分离碱性化合物时容易产生脱尾、变宽、保留延长等现象。,硅胶表面性质,解决方案加入适当的扫尾剂如三乙胺可以掩蔽残留的硅羟基，使碱性化合物峰形变好降低流动相pH值小于3,可以减小硅羟基的反应,从而减小拖尾现象目的残留的硅羟基影响最小；碱性化合物不拖尾；改善选择性；一般优先使用高封尾的色谱柱；低封尾或不封尾的C18色谱柱，可用于100%的水相，因为硅羟基的影响，对极性相同的化合物有特殊选择性（LP系列（pH18）未封尾）；pH使用范围宽。不足点酸性条件下，氢离子通过未封端的Si-OH的间隙进攻-Si-C键，导致填料水解；封尾的基团会影响色谱柱的使用pH值、对化合物的选择性等；,热点应用,为什么需要制样？,浓度太低-被测物浓度低于定量限样品太“脏”-基体中含有其它组分，干扰测定太“危险”-污染物可能成为“色谱柱杀手”,采样GC,HPLC,orLC-MS/MS分析,X,原初样品=不适合进一步分析!为什么?,真实世界中的真实样品,鳄梨中的农药残留分析（不用SPE）,样品前处理过程中的常用技术,稀释进样过滤基质沉淀平衡透析/超滤液液萃取固相微萃取)固相萃取(离线/在线)逆流色谱分子印迹技术（MIPs）免疫亲和色谱,弱的选择性样品净化浓缩效果差更强的选择性样品净化浓缩效果最佳,与液液萃取相比，SPE的优势,样品处理量增加减少有机溶剂用量和有机废弃物的产生增加回收率，改善重现性纯化提取物无乳化现象多种不同选择性可自动化处理,多农药残留分析QuEChERS方法,15g样品加入50-mL离心管（1）,加入10-mL含1%乙酸的乙腈+内标（2）,加入WEL-QE-02盐析包，剧烈震荡1min（4）,剧烈振摇1min（3）,4000rpm离心5min（5）,移取上清液待净化,样品：菠菜,一、萃取,多农药残留分析QuEChERS方法,1ml萃取上清液于2ml离心管中（6）,加入盐析包WEL-QC-1102（7）,剧烈振摇1min（8）,13000rpm离心2min（9）,二、净化,用GC-MS分析,多农药残留分析QuEChERS方法,三、上机检测,气相色谱条件进样口：不分流色谱柱：WM-5ms气相柱30m0.25mm,0.25m载气：氦气(恒压)柱温：70(2min),25/min升至150(0min)程序：3/min至200(0min),8/min至280进样量：1.0l质谱仪条件模式：SIM离子源、四级杆传输管线温度：分别为230、150和280溶剂延迟：3min,多农药残留分析QuEChERS方法,四、谱图,多农药残留分析QuEChERS方法,五、数据,多农药残留分析QuEChERS方法,菠菜提取液中不同浓度WelchromGraphiCarb的净化效果,地沟油中PAH的检测,仪器：伍丰LC-100高效液相色谱仪色谱柱：月旭UltimatePAH,4.6250mm，5m检测波长：220nm流动相：A：水B：乙腈梯度程序：0-20min40-100%B20-33min100%B33-34min100-40%B柱温：25流速：1.5mL/min进样量：10L,食品中PAEs的检测,仪器：伍丰LC-100高效液相色谱仪色谱柱：月旭UltimateAQ-C18,4.6250mm，5m检测波长：230nm流动相：A：水B：乙腈梯度洗脱柱温：30流速：1mL/min进样量：10L,1、邻苯二甲酸二甲酯（DMP）2、邻苯二甲酸二乙酯（DEP）3、邻苯二甲酸二丙酯（DPRP）4、邻苯二甲酸丁卞酯（BBP）5、邻苯二甲酸二异丁酯（DIBP）或邻苯二甲酸二正丁酯（DBP）6、邻苯二甲酸二戊酯（DPP）7、邻苯二甲酸二环己酯（DCHP）8、邻苯二甲酸二己酯（DNP）9、邻苯二甲酸二苯酯（DPHP）10、己二酸二辛酯（DEHA）11、邻苯二甲酸二异辛酯（DIOP）12、邻苯二甲酸二（2-乙基己）酯（DEHP）13、邻苯二甲酸二正辛酯（DNOP）14、邻苯二甲酸二异壬酯（DINP）或邻苯二甲酸二壬酯（DNP）15、邻苯二甲酸二异葵酯（DIDP）,SPE小柱：WelchromGLASSC8（200mg/6ml，货号：WSS46080602-G）WelchromGLASSPSA（200mg/6ml，货号：WSS4608PS0602-G）,奶和奶制品中三聚氰胺的测定,制备样品,WelchromP-SCX小柱配方奶和奶制品中检测三聚氰胺WelchromP-SCX60mg/3cc，Cat.No.：WSP020306,活化/平衡：3ml甲醇/3ml水,上样：酸化基液后上样，控制流速,淋洗：3ml水/3ml甲醇一次洗涤,洗脱：3ml5%氨化甲醇洗脱、收集,重新溶解：氮吹至干后，1ml20%MeOH溶解,奶粉中三聚氰胺,pKa=8,奶和奶制品中三聚氰酸的测定,制备样品,WelchromP-SAX小柱配方奶和奶制品中检测三聚氰胺WelchromP-SAX60mg/3ml，Cat.No.：WSP030306,活化/平衡：3ml甲醇/3ml水,上样：碱化基液后上样，控制流速,淋洗：3ml水/3ml甲醇一次洗涤,洗脱：3ml2%甲酸甲醇洗脱、收集,重新溶解：氮吹至干后，1ml20%MeOH溶解,奶粉中三聚氰酸,蟾酥药材,仪器：伍丰LC-100高效液相色谱仪色谱柱：UltimateLP-C18，4.6250mm，5m；检测波长：296nm；流动相：乙腈：0.5%磷酸二氢钾溶液=58：42；温度：40度；流速：1.0ml/min；进样量：20l；对照品：1、华蟾酥毒基2、酯蟾酥毒基,对照品,供试品,刺五加浸膏,仪器：伍丰LC-100高效液相色谱仪色谱柱：UltimateXB-C184.6250mm5m；检测波长：220nm；流动相：梯度方法；A：乙腈B：0.1%的磷酸水溶液流速：1.0ml/min；进样量：20l；对照品：紫丁香苷,供试放大,对照品,供试品,浓缩六味地黄丸马钱苷,仪器：伍丰LC-100高效液相色谱仪色谱柱：WelchromC184.6250mm，5m；检测波长：236nm；流动相：四氢呋喃-甲醇-乙腈-0.05%磷酸溶液=1:4:8:87；温度：40度；流速：1.0ml/min；进样量：20l；对照品：马钱苷,对照品,供试品,麻黄药材,仪器：伍丰LC-100高效液相色谱仪色谱柱：UltimatePhenyl-Ether4.6250mm,5m；检测波长：210nm；流动相：甲醇-0.092%磷酸溶液（含0.04%三乙胺和0.02%正丁胺）=1.5：98.5；温度：室温24度；流速：1.0ml/min；进样量：10l；对照品：1、盐酸麻黄碱2、盐酸伪麻黄碱,对照品,供试品,他克莫司软膏,仪器：伍丰LC-100高效液相色谱仪色谱柱：UltimateDiol，5um，4.6250mm；检测波长：225nm；流动相：正己烷：正丁基氯：乙腈7：2：1；温度：室温；流速：1.7ml/min；进样量：5ul；对照品：他克莫司,对照品,供试品,贝前列素钠,仪器：伍丰LC-100高效液相色谱仪色谱柱：UltimateXB-C18，；检测波长：285nm；流动相：甲醇-水-冰醋酸=60:40:1；温度：40度；流速：0.7mL/min；进样量：20L。要求两者之间分离度大于1.5,4.6150mm，3m分离度=2.33,3.0150mm，3m分离度=1.69,奥美拉唑（Ch.P.）,仪器：伍丰LC-100高效液相色谱仪色谱柱：XtimateC85um，4.6250mm；检测波长：280nm；流动相：10mmol/L磷酸氢二钠溶液（用磷酸调节pH值至7.6)-乙腈=70:30；温度：室温24度；流速：1.0ml/min；进样量：20l；物质名称：1、奥美拉唑2、奥美拉唑黄酰化物要求两者之间分离度大于2,有关物质系统实验分离度=3.35,仪器：伍丰LC-100高效液相色谱仪色谱柱：UltimateLP-C18，4.6300mm，5m；检测波长：280nm；流动相：1.4g/L磷酸氢二钠用磷酸调节pH到7.6：乙腈=72:28；温度：30度；流速：1.0ml/min；进样量：20L物质名称：1、奥美拉唑2、奥美拉唑黄酰化物要求两者之间分离度大于3,奥美拉唑（E.P.）,有关物质系统实验分离度=3.36,复方甘草口服液无水吗啡,仪器：伍丰LC-100高效液相色谱仪SPE柱：WelchromC18E,17%载碳量,200mg/3mL;活化：5ml甲醇：水=3：1（体积比）平衡：氨水溶液（pH=10，广泛pH试纸测定），测定流出液pH=10时为平衡OK;上样：取无水吗啡对照品0.5mL（滴加浓氨水2滴，PH10），混匀后过柱，20mL纯水淋洗。洗脱：5%醋酸溶液洗脱收集。定容至10mL。进样20L测定分析。样品分析：上样液取0.5mL滴加浓氨水1滴，混匀后过柱色谱柱：UltimateXB-C84.6mm*150mm，3m流动相：乙腈-0.0025mol/L庚烷磺酸钠-0.05mol/L磷酸二氢钾（5:18:18）流速：0.7mL/min柱温：室温检测波长：220nm,供试品,对照品,更昔洛韦,仪器：伍丰LC-100高效液相色谱仪色谱柱：UltimateLP-C184.6250mm,5um；检测波长：252nm；流动相：甲醇：水=5：95；温度：室温25度；流速：1.0ml/min；进样量：20ul；,有关物质供试品分离度=11.54,1.98,利巴韦林原药,仪器：伍丰LC-100高效液相色谱仪色谱柱：XtimateTMSUGAR-H7.8300mm,5um；检测波长：207nm；流动相：pH=2.5硫酸水溶液；温度：室温21度；流速：0.4ml/min；进样量：20l；,有关物质供试品,含量供试品,有关物质供试品放大,利培酮片,仪器：伍丰LC-100高效液相色谱仪色谱柱：C18；检测波长：275nm；流动相：0.5%乙酸铵（用三乙胺调节pH至7.0）-乙腈=78:22；温度：室温25度；流速：1.5ml/min；进样量：10l；,XtimateTM（4.6100mm,3m）,UltimateXB-C18（4.675mm,3m）,头孢氨苄原药,有关物质系统实验分离度=1.72，1.81,杂质对照分离度=13.52,苯甘氨酸杂质对照,仪器：伍丰LC-100高效液相色谱仪色谱柱：UltimateAQ-C18，5um，4.6250mm；检测波长：220nm；流动相：A相：0.2mol/L的磷酸二氢钠（NaOH调节PH为5.0），B相：甲醇；温度：室温；流速：1.0ml/min；进样量：5l；要求杂质与主峰分离大于1.5,头孢泊肟酯原药,异构体分离度分离度=5.489,有关物质系统实验分离度=2.39,2.38,要求杂质与主峰分离大于1.5,仪器：伍丰LC-100高效液相色谱仪色谱柱：UltimateXB-C184.6150mm，5um；检测波长：240nm；流动相：甲醇-水=45：55；温度：40度；流速：1.0ml/min；进样量：20l；,维护,日常维护,正向使用反向冲洗,日常维护,流动相中不含缓冲盐流动相冲至样品完全流出-90%的有机溶剂冲洗20倍柱体积流动相中有缓冲盐流动相冲至样品完全流出-过度流动相冲洗20倍柱体积-90%的有机溶剂冲洗20倍柱体积流动相中有离子对试剂流动相冲至样品完全流出-过度流动相冲洗20倍柱体积-50%甲醇冲洗20倍柱体积-90%的有机溶剂冲洗20倍柱体积,过渡流动相：有机相和水相的比例和分析流动相中两相比例一致，或者水相比例高于分析流动相，绝对不含缓冲盐。,色谱柱故障,柱压高柱效低分离度降低峰形异常保留时间变化柱寿命不理想等,柱压高解决方案,查找原因,系统压力高,是否由色谱柱引起,正常,异常,排除,色谱柱堵塞,在线过滤器堵塞保护柱堵塞筛板堵塞填料变性,柱压高解决方案,堵塞可能原因外源性杂质样品或者是流动相中未过滤掉的杂质；内源性的杂质泵中柱塞杆与密封圈磨损后产生的碎屑；PEEK管老化产生的颗粒；进样阀中密封圈老化产生的杂质；等。,柱压高解决方案,柱压高解决方案,填料变性可能的原因：蛋白类样品累积；强保留物质富集；缓冲盐析出；基质破碎；等解决方案：使用SPE等更加有效的前处理方法；过渡；在pH范围内使用；柱子冲洗；等,伴随柱效降低分离度降低峰形异常,柱压高解决方案,用比你的流动相更强的溶剂冲洗反相HPLC(如反相色谱填料RP-18,RP-8等)为了增加强度选择极性小的溶剂水甲醇乙腈异丙醇正相HPLC(如SiO2,NH2,CN,DIOL基色谱填料)为了增加强度选择极性大的溶剂正己烷二氯甲烷乙酸乙酯异丙醇乙腈去除蛋白：乙腈：水：三氟乙酸=50：50：0.1,柱子清洗-强保留物质,柱压高解决方案,柱子清洗-缓冲盐析出：方案1：用过渡流动相以1.0ml/min流速35条件下反向冲洗色谱柱120min；方案2：用过渡流动相以0.2ml/min流速反向冲洗色谱柱过夜。避免缓冲盐析出，因为缓冲盐析出是很难除去的,花费太多的时间用于色谱柱再生而不能保证正常的分析工作是得不偿失的。,柱污染柱外死体积增大流动相成分变化仪器故障键合相流失保护柱污染等,可能原因,解决方案,柱冲洗恢复仪器重新配置流动相排除故障更换新柱更换保护柱芯等,柱效降低解决方案,伴随分离度降低峰形异常,常见异常峰形,前延峰；拖尾峰；叉峰（裂峰）；宽峰/馒头峰。,解决方案,样品过载,前拖、后拖或平头峰,T=2.248500ug/ml,T=1.0685ug/ml,前延峰：又称前伸峰、伸舌头峰。前沿平缓，后沿陡峭的不对称色谱峰称前延峰。参数拖尾因子（T）或对称因子来衡量。解决方案溶剂效应-强溶剂溶解，流动相稀释缓冲作用不适合-增加缓冲仪器系统不匹配-减小系统死体积柱温太低-适当升高柱温的温度色谱柱损坏(筛板阻塞和柱头塌陷)-维修色谱柱色谱柱污染-冲洗色谱柱等,前延峰解决方案,拖尾峰：前沿陡峭，后沿较前沿平缓的不对称峰。参数拖尾因子（T）或对称因子来衡量。解决方案降低pH-抑制硅羟基电合适的缓冲能力-更换缓冲盐增加缓冲作用增加缓冲盐或加大浓度屏蔽硅羟基添加扫尾剂三乙胺色谱柱损坏(筛板阻塞和柱头塌陷)-维修色谱柱色谱柱污染-冲洗色谱柱等,拖尾峰解决方案,常见缓冲盐的PH值,缓冲液pKapH范围