生物工程综合实验1

生物工程综合实验（二）结果汇报,汇报人：（实验第3小组）蒋秀云、蒋阳辉、黄体欢2011年11月8日,固态发酵实验米曲霉的培养及蛋白酶的活性分析,固态培养基配方：,培养基设计方案的目的：,采用单一因素法，在其他条件一定的情况下，考察研究培养基的含水量对酶活力的影响。,实验数据记录,实验结果,由上表数据进行处理后得到以下结果：1、成曲霉水分含量:配方一：39.23%;配方二：61.53%;配方三：72.80%2、成曲蛋白酶活力：配方一：1079.91U/g；配方二：11731.14U/g；配方三：6968.53U/g,实验结果分析讨论,培养基加水量对米曲霉产酶的影响,从图可知,随着加水量增加米曲霉产中性蛋白酶和碱性蛋白酶的酶活逐渐增高;当加水量为50%时,其酶活力最高;随着加水量继续增大其酶活逐渐下降。这可能是因为低水分使米曲霉种曲培养基中营养物质的溶解性下降,而高水分使种曲培养基多孔性降低、微粒结构损失,同时黏度增加使透气性下降,减小气体的交换和空气中菌丝体的数量。所以水分含量过高过低对米曲霉代谢和蛋白酶的合成都有影响。,时间对米曲霉产酶的影响,由图可知,66h时中性蛋白酶和碱性蛋白酶的酶活最大为60712U/g、48219U/g;72h时蛋白酶酶活下降。这可能是因为菌体死亡导致细胞出现自溶现象,同时酶的部分分解也会使酶活力下降。,结果分析和讨论,分析：经小组讨论，分析产生上述结果的主要原因是因为低水分使米曲霉种曲培养基中营养物质的溶解性下降，从而使蛋白酶活力降低；而高水分使种曲培养基多孔性降低、微粒结构损失，同时黏度增加使通透性下降，减小了气体的交换和空气中菌丝体的数量，从而也导致蛋白酶活力降低。还有是因为菌体死亡导致细胞出现自溶现象,同时酶的部分分解也会使酶活力下降。结论：培养基含水量过高或过低对米曲霉的代谢和蛋白酶的合成及其活力都有影响。,米曲霉中性蛋白酶的分离纯化研究,双水相萃取分离实验方案设计：母液：PEG100060%(m/m)；柠檬酸钠30%(m/m),实验数据记录,粗酶液：蛋白浓度0.675mg/mL（稀释倍数12）；空白OD595nm：0.5690.543；酶液OD595nm：0.9910.995中性蛋白酶活力：48.55U/mL（稀释倍数10）；空白OD275nm：0.6970.691；酶液OD275nm：1.1881.171,双水相体系1：PEG100024%，柠檬酸钠12%（总质量20g）,上相：体积Vt13mL；蛋白浓度0.0414mg/mL（稀释倍数4）；空白OD595nm：0.8170.822酶液OD595nm：0.9400.921中性蛋白酶活力2.56U/mL（稀释倍数2）；空白OD275nm：0.6040.605；酶液OD275nm：0.7200.745下相：体积Vb4.8mL,双水相体系2：PEG100024%，柠檬酸钠15%（总质量20g）,上相：体积Vt10.5mL；蛋白浓度0.0583mg/mL（稀释倍数4）；空白OD595nm：0.8110.813；酶液OD595nm：0.9540.952中性蛋白酶活力2.09U/mL（稀释倍数2）；空白OD275nm：0.6270.625；酶液OD275nm：0.7380.723下相：体积Vb7mL,双水相体系3：PEG100024%，柠檬酸钠18%（总质量20g）,上相：体积Vt9.5mL；蛋白浓度0.0969mg/mL（稀释倍数4）；空白OD595nm：0.8100.813；酶液OD595nm：1.0231.019中性蛋白酶活力3.73U/mL（稀释倍数2）；空白OD275nm：0.6070.603；酶液OD275nm：0.7840.799下相：体积Vb8mL,双水相体系分离米曲霉中性蛋白酶结果,实验结果分析和讨论一、粗酶液质量浓度对酶分配的影响,由表2可见,随着粗酶质量浓度的增大,酶的分配系数、萃取率、纯化倍数都相应地增大,但当粗酶质量浓度增大至8g/L以上时,粗酶液须经稀释才能在紫外分光仪上测出活力,不利于操作,故未列出数据.,二、相比对酶分配的影响,实验数据表明,相比对酶的纯化倍数影响较大.随着相比的增大,纯化倍数亦增大,相比接近3的时候,纯化倍数可达到4.21.相比越大意味着上相的PEG在体系中的质量分数越大,亦即此时处于系统相图中的长系线位置,体系远离临界点,在一定范围内,长系线长度处酶分配系数增大.但在体积一定的萃取器中,相体积比过大(如3),不仅在操作上不方便,而且还增大了PEG用量,据此相比取2左右比较合适。,结果分析和讨论,分析：经小组讨论产生上述原因，首先相比较低，从而导致对酶的分离和纯化的效果不很理想。而产生相比低的原因是因为PEG1000和柠檬酸钠的分配比例不是很合适，