核酸杂交技术

第四章核酸杂交技术,目录,第一节核酸分子杂交的概念一、核酸探针二、分子杂交信号检测第二节经典的核酸分子杂交技术一、固相杂交二、液相杂交,目录,第四节影响杂交信号检测的因素一、探针的选择二、探针的标记方法三、探针的浓度四、杂交率五、杂交温度六、杂交的严格谨性七、杂交反应时间八、杂交促进剂,核酸分子杂交(molecularhybridizationofnucleicacid),核酸分子杂交：单链的核酸分子在合适的条件下，与具有碱基互补序列的异源核酸形成双链杂交体的过程。核酸分子杂交技术：利用核酸分子杂交检测靶序列的一类技术称核酸分子杂交技术。核酸分子杂交技术目前应用广泛，是定性或定量检测特异RNA或DNA序列片段的有力工具。,第一节核酸分子杂交的概念,变性退火复性,核酸分子杂交的基本原理,1、变性（denaturation）定义：在一定的条件下，双螺旋之间氢键断裂，双螺旋解开，形成无规则线团，双链解链成为单链。,2、融解温度(MeltingTemperature,Tm)定义：在DNA热变性时，其A260的升高达最大值一半时的温度。,影响Tm的因素：（1）DNA碱基的组成G-C含量越多Tm值越高A-T含量越多Tm值越低（2）溶液的离子强度低离子强度Tm值越低高离子强度Tm值越高（3）pH值pH值5-9Tm值变化不明显pH11不利于氢键形成（4）变性剂干扰碱基堆积力和氢键的形成,3.复性变性DNA经过一定处理重新形成双螺旋的过程。,影响复性速度的因素：DNA浓度DNA片段的大小DNA片段复杂性合适的复性温度适当的离子强度,重点提示,分子杂交：指具有一定同源序列的两条核酸单链（DNA或RNA），在一定条件下按碱基互补配对原则经过退火处理，形成异质双链的过程。利用这一原理，就可以使用已知序列的单链核酸片段作为探针，去查找各种不同来源的基因组DNA分子中的同源基因或同源序列。,一、核酸探针,核酸探针指能与靶核酸序列发生碱基互补杂交，并能由其标记被特异性检测的核酸分子。,探针的种类,寡核苷酸探针,基因组DNA探针,cDNA探针,RNA探针,DNA探针,（一）常用探针的种类,1.DNA探针最常用的核酸探针,三大优点：这类探针大多克隆在质粒载体中，可以无限繁殖，制备方法简便；DNA探针相对不易被降解，一般DNA酶活性能有效地被抑制；DNA探针的标记方法较成熟，有多种方法可供选择，如缺口平移法、随机引物法、PCR标记法等，能用于放射性核素和非放射性物质标记。,2.RNA探针,优点：杂交效率高，稳定性高，非特异性杂交较少，未杂交探针可用RNase降解，减少本底的干扰。缺点：易降解，标记方法复杂。,3.寡核苷酸探针,寡核苷酸探针一般由1750个核苷酸组成。优势：可以区分仅仅一个碱基差别的靶序列；缺陷：寡核苷酸不如长的杂化核酸分子稳定，需优化杂交和洗脱条件以保证寡核苷酸探针杂交的特异性。,（二）探针的长度,1.DNA和RNA探针DNA探针通常为400500个碱基2.寡核苷酸探针探针的最小长度取决于其靶序列的复杂性,（三）核酸探针的标记,1.探针标记物的选择（1）放射性标记（2）非放射性标记根据标记物掺入情况可分为均匀标记和末端标记探针。,不同标记类型探针的比较：,2.探针标记方法的选择,制备探针步骤：探针标记清除未标记的核酸探针检测探针标记效率,随机引物：含有各种可能排列顺序的寡核苷酸片段的混合物。,DNA聚合酶Klenow片段：保留53DNA聚合酶活性,弱35外切酶活性，无53外切酶活性。,（1）DNA随机引物标记,32P-部分标记的单链DNA片段,-32P-dCTP,dATP，dGTP，dTTP,DNA酶：在双链DNA上随机打开若干个单链缺口，产生3-OH端。,大肠杆菌DNA聚合酶：53DNA聚合酶活性；53外切核酸酶活性。,（2）DNA切口平移标记,条件是有5-OH存在，人工合成寡核苷酸最常用；双链DNA需用碱性磷酸酶切除5-P后再标记,5p-HO-CpGpTpA3,5HO-CpGpTpA3,T4噬菌体多核苷酸激酶,-32P-ATP,532p-O-CpGpTpA3,37，反应10min,-32P-ATP需150ci/反应,1)DNA的5末端标记,碱性磷酸酶,(3)DNA的末端标记,完整双链DNA,-32P-dNTP,其他3种dNTP,5末端突出的DNA,3末端标记的DNA,32P-末端标记的单链DNA探针,2)DNA的3末端标记,二、分子杂交信号检测,（一）放射性标记探针检测1、放射自显影2、液体闪烁计数法（二）非放射性标记探针的杂交检测1、酶促显色检测2、荧光检测3、化学发光检测4、多探针检测,（一）放射性标记探针检测,1.放射自显影放射性杂交的检测基于放射性核素释放的能量将照片纸感光的原理。用32P标记杂交最常用的检测方法是放射自显影。,2.液体闪烁计数法,液体闪烁计数法的工作原理是被测样品辐射发出的辐射能经溶剂分子传递给闪烁剂分子，当被激发的闪烁剂分子从激发态退激为稳态时，以荧光光子的形式辐射能量，经光电倍增管放大并被测量，就可以实现对放射性核素的测定。,（二）非放射性标记探针的杂交检测,1.酶促显色检测（1）直接检测酶本身作为标记分子掺入到核酸中去，在洗脱后就可直接进行检测。酶直接作用于显色的底物，产生颜色沉淀，显色沉淀可用肉眼检测。酶直接作用于化学发光的底物发光,发光的检测要依赖于对蓝光敏感的X胶片。这种检测法常用于寡核苷酸探针杂交，这类杂交反应温度低。,碱性磷酸酶显色反应示意图,HRP酶显色反应示意图,(DAB),(TMB),Dig：半抗原，可通过抗原抗体反应系统与显色体系偶联,Dig-DNA探针+抗Dig抗体-碱性磷酸酶（或辣根过氧化物酶）+底物,（2）间接检测,检测含地高辛、荧光素或生物素标记的探针时，就要增加一个将酶连接到杂化核酸分子上的步骤。,荧光素：一类能在激发光作用下发射出荧光的物质荧光显微镜观察、免疫组织化学法,2荧光检测,化学发光是指化学反应中释放的能量以光的形式发射出来形成检测信号。化学发光酶免疫技术中目前常用的酶有碱性磷酸酶及辣根过氧化物酶发射光线的强度反映了酶的活性，反应了杂化分子的量。,3化学发光底物,辣根过氧化物酶催化的化学发光反应,采用发色体检测的最大益处是可同时检测一个以上的杂化分子每种探针分别用不同的报告基团如生物素、荧光素和地高辛标记并同时与固定在滤膜上的核酸杂交采用不同的链霉抗生素或抗体-酶和相应底物组合,4多探针检测,第二节经典的核酸分子杂交技术,核酸分子杂交分类,根据杂交核酸分子的种类DNA与DNA杂交DNA与RNA杂交RNA与RNA杂交,根据杂交探针标记同位素杂交非同位素杂交,分子杂交技术一般过程,探针制备及标记（同位素或非同位素）待测核酸样品制备（分离，纯化）杂交（液相，固相，原位杂交）杂交后处理（去掉非特异杂交分子）显示结果（显色，发光，放射自显影）结果分析,固相杂交：,先将待测单链核酸样品结合到固相支持物（常用有硝酸纤维素滤膜、尼龙膜、化学活化膜等）上，然后与溶液中的已知序列的标记探针进行杂交，放射自显影分析杂交结果。,（一）反向点杂交,反向点杂交（reversedotblot,RDB）是将多种探针固定在同一膜上，同时参与检测的样品DNA又互不干扰，故能一次性筛查出多种不同的序列。特点：简单、快捷、特异性强、稳定性好较Northernblot省去了电泳和毛细转膜过程,（二）Southern印迹杂交,Southern印迹杂交（Southernblothybridization/Southernblotting）是指DNA与DNA分子之间的杂交。可用于基因组DNA的定性与定量分析，重组质粒和噬菌体的分析等。,（二）Southern印迹杂交,包括两个主要过程：将待测定核酸分子通过一定的方法转移并结合到一定的固相支持物（硝酸纤维素膜或尼龙膜）上，即印迹（blotting）。固定于膜上的核酸与同位素标记的探针在一定的温度和离子强度下退火，即分子杂交过程。,Southern印迹杂交的基本步骤：,待测DNA样品的限制性内切酶消化酶切DNA样品的电泳分离凝胶中DNA的变性和Southern转移探针的制备Southern杂交杂交结果的检测,Southern杂交的应用,应用单基因遗传病的基因诊断基因点突变的检测临床应用用于下列疾病的产前诊断镰型细胞贫血苯丙酮酸尿症珠蛋白合成障碍性贫血假肥大型肌营养不良血友病慢性进行型舞蹈病,（三）Northern印迹杂交,Northern印迹（Northernblot）杂交是应用DNA探针检测特异mRNA的另一种膜上印迹技术。此项技术的原理和过程与Southern印迹基本相同，只是检测的分子是RNA，可用来对组织或细胞中的mRNA进行定性或定量分析。,Northern杂交应用,1.RNA病毒的检测2.基因表达的检测Northern印迹技术被认为是检测基因表达水平的金标准。,二、液相杂交,液相杂交是指待测核酸和探针都存在于杂交液中，探针与待测核酸在液体环境中按照碱基互补配对形成杂交分子的过程。,液相杂交,一种研究最早且操作简便的杂交类型。原理和反应条件与固相杂交基本相同，仅是将待检测的核酸样品和杂交探针同时溶于杂交液中进行反应。液相杂交后过量的未杂交探针在溶液中除去较困难，同源与异源的DNA分子在杂交的过程中会发生竞争，使得杂交结果的分析十分困难。因此液相杂交应用较少,三、原位杂交,应用核酸探针与组织或细胞中的核酸按碱基配对原则进行特异性结合形成杂交体，然后应用组织细胞化学或免疫组织化学方法在显微镜下进行细胞内定位或基因表达的检测技术。,（一）基本操作步骤：,杂交前准备：保持细胞形态结构、保存核酸、增加组织的通透性、减低背景。杂交：使探针与细胞中的把序列结合。杂交后处理：盐溶液的漂洗，以减少背景。显示：根据核酸探针标志物的种类选择相应的检测系统。,（二）原位杂交的应用,1.细胞遗传学分析产前诊断生殖医学中的应用血液疾病中染色体易位的检测实体瘤研究2.比较基因组杂交3.基因图谱绘制4.病原学检测,荧光原位杂交(FISH,FluorescenceinsituHybridization),利用荧光标记的探针与待测标本的核酸进行原位杂交，在荧光显微镜下对荧光信号进行辨别和计数，从而对染色体或基因异常的细胞、组织标本进行检测和诊断,核酸分子杂交技术类型,第四节影响杂交信号检测的因素,在核酸杂交反应中影响杂交体形成因素较多，主要有探针的选择、探针的标记方法、探针的浓度、杂交率、杂交最适温度、杂交的严谨性、杂交反应时间及杂交促进剂等。,一、探针的选择,在大多数情况下，可以选择克隆的DNA或cDNA双链探针。但是在有些情况下，必须选用其它类型的探针如寡核苷酸探针和RNA探针。,二、探针的标记方法,探针的标记方法很多，选择什么标记方法主要视个人的习惯和可利用条件而定。但在选择标记方法时，还应考虑实验的要求，如灵敏度和显示方法等。一般认为放射性探针比非放射性探针的灵敏度高。,三、探针的浓度,随探针浓度增加，杂交率也增加。在较窄的范围内，随探针浓度增加，敏感性增加。探针浓度过低会降低杂交的灵敏度，过高又会增加背景的染色。一般认为，最佳原则是应用与靶核苷酸探针达到最大结合度的最低探针浓度。,四、杂交率,传统杂交率分析主要用于DNA复性研究，在这种情况下，探针和靶链在溶液中的浓度相同。现代杂交实验无论在液相杂交还是固相杂交均在探针过剩的条件下进行，此外，固相杂交中靶序列不在液相，故其浓度不能精确计算。,五、杂交温度,理想的情况是在杂交速率最大的温度条件下进行杂交反应对RNA：DNA杂交来说，最大速率的产生点为Tm值下1015；在DNA：DNA杂交中选择低于Tm值2025的杂交温度。,六、杂交的严谨性,严谨性（stringency)是指杂交体系避免非同源性或部分同源性的核酸序列形成杂交复合物的严格程度。影响杂交体稳定性的因素决定着杂交条件的严谨性，一般认为在低于杂交体Tm值25时杂交最佳，所以首先要根据公式计算杂交体Tm值。通过调节盐浓度、甲酰胺浓度和杂交温度来控制所需的严格性。,七、杂交反应时间,C0t1/2是杂交反应进行一半时杂化分子的浓度，C0t1/2越大反